易错PCR介导扩展青霉脂肪酶定向进化

摘要

本研究利用易错PCR技术对扩展青霉脂肪酶PEL进行定向进化。以扩展青酶脂肪酶基因为模板,通过易错PCR和转化毕赤酵母建立了约含13000个突变株的突变体库；通过酶活性的平板透明圈高通量的筛选获得了约50株的有活性的转化子；通过酶学特性分析和基因克隆测序,筛选出如下热稳定性和酶活有所改变的突变体。
　　 (1)突变体GS-pPIC3.5K-lip07-ER04,其最适作用温度比野生型提高10℃,在最适作用温度下的酶活提高了约22％,Tm值比野生型提高了3.28℃。
　　 (2)突变体GS-pPIC3.5K-lip07-ER10最适作用温度比野生型提高了5℃,在最适作用温度下的酶活为950U/mL,Tm值比野生型提高了2.15℃。
　　 (3)突变体GS-pPIC3.5K-lip07-ER15的最适作用温度没有发生变化,在最适作用温度下的酶活为935U/mL,Tm值比野生型提高了2.28℃。
　　 (4)突变体GS-pPIC3.5K-lip07-ER17最适作用温度比野生型提高了5℃,在最适作用温度下的酶活为1005U/mL,Tm值比野生型提高了1.8℃。
　　 (5)突变体GS-pPIC3.5K-lip07-ER31最适作用温度比野生型提高了5℃,在最适作用温度下的酶活为917U/mL,Tm值比野生型提高了2.25℃。
　　 (6)突变体GS-pPIC3.5K-Lip07-ER38的最适作用温度没有发生变化,在最适作用温度下的酶活为1105U/mL,Tm值比野生型提高了2.81℃。
　　 (7)突变体GS-pPIC3.5K-lip07-ER45的最适作用温度未发生变化,在最适作用温度下的酶活为1060U/mL,Tm值比野生型提高了2.26℃。
　　 (8)突变体GS-pPIC3.5K-lip07-ER50的最适作用温度未发生变化,在最适作用温度下的酶活为425U/mL,降低了约42％,Tm值40.4℃。
　　 (9)突变体:HR1、HR2、HR5的最适温度最适作用温度未发生变化,在最适作用温度下的酶活分别为720U/mL、612U/mL、762U/mL,变化并不明显。
　　 本研究共筛选出十一个突变体,其中七个热稳定性和酶活得以提高的正向突变体,结果说明易错PCR介导的定向突变是种很好的酶分子改造的手段,这些突变体的获得为进一步的脂肪酶定向进化打下了基础。