易错PCR定向进化扩展青霉FS1884脂肪酶

摘要

扩展青霉(Penicillium expansum)FS1884碱性脂肪酶(PEL)已被广泛应用,为进一步增强工业适用性,获得活性更高,耐酸碱等性质进化的脂肪酶,本文利用连续两轮易错PCR对扩展青霉FS1884碱性脂肪酶进行随机突变,在大肠杆菌内构建了约106个突变克隆子的脂肪酶基因突变文库,将携带突变脂肪酶基因的重组质粒pPIC3.5K-ep-PEL转化巴斯德毕赤酵母GS115,经过YPOM板和橄榄油检验板的筛选,获得突变体GS-ep25-PEL、GS—ep10-PEL、GS—ep33-PEL、GS-ep43-PEL、GS-ep51-PEL和GS-ep81-PEL,并对上述突变体进行酶学性质鉴定。
　　 结果显示,GS-ep25-PEL最适温度为40℃,该温度下酶活力为1912.5U/mL,是毕赤酵母中野生型脂肪酶(GS-PEL)在该条件下酶活的130％,Tm值为40℃,pH11.0时有最高酶活。GS-ep10-PEL的最适温度为35℃,酶活力为2478.7 U/mL,是GS-PEL酶活力的168.6％,Tm值为40.2℃,pH11.0时酶活最高。GS-ep33-PEL最适作用温度没有发生变化,40℃时酶活力为1561.67 U/mL,是GS-PEL的106.2％,Tm值是39.9℃,比GS-PEL降低0.4℃,最适pH不变。GS-ep43-PEL最适温度为40℃,该温度下酶活力为895.44U/mL,是GS-PEL的60.9％,Tm值是36.6℃,比GS-PEL降低3.6℃。GS-ep51-PEL最适温度为40℃,该温度下酶活力为1448.4U/mL,是GS-PEL的98.5％,Tm值为40.5℃,比GS-PEL提高0.2℃。GS-ep81-PEL最适温度为40℃,该温度下酶活力为1540.3U/mL,是GS-PEL的104.7％,Tm值是38.8℃,比GS-PEL降低了1.5℃。
　　 测序结果显示,GS-ep25-PEL,GS-ep10-PEL,GS—ep33-PEL和GS-ep43-PEL脂肪酶突变体基因长度都未发生改变。与GS-PEL比较,突变脂肪酶GS-ep25-PEL产生一个氨基酸突变,即K253M。突变脂肪酶GS-ep10-PEL有四个氨基酸发生变化,分别为1104T,A188T,G192S,K253M。GS-ep33-PEL有三个氨基酸发生突变,它们是A18T,K147M,D150E。GS-ep43-PEL产生两个氨基酸突变,分别是K63R以及R128G。