miR-186海绵载体的构建及其在EA.hy926细胞株中的表达

摘要

目的 :构建微小RNA-186(miR-186)基因的海绵载体,建立稳定敲减miR-186的EA.hy926细胞株.方法 :化学合成miR-186海绵体序列,并克隆到慢病毒FV040表达载体上;采用lipofectamine 2000共转染FV040-miR-186-sponge载体和慢病毒辅助包装质粒到HEK293T细胞,包装慢病毒,测定病毒滴度;FV040-control慢病毒作为对照组,FV040-miR-186-sponge作为实验组,分别感染EA.hy926细胞,筛选稳转细胞株;采用荧光定量PCR(qPCR)法检测空白对照组、FV040-control对照组及FV040-miR-186-sponge实验组中EA.hy926细胞miR-186的相对表达水平.结果 :测序结果显示克隆的目的基因序列与设计的miR-186海绵体序列完全一致.在感染的EA.hy926细胞中观察到绿色荧光蛋白(GFP)的表达.FV040-control包装的慢病毒滴度为2×108 T U·mL-1,FV040-miR-186-sponge组慢病毒滴度为6×108 T U·mL-1;成功建立了稳定表达miR-186-sponge的EA.hy926细胞株,感染效率达95％;qPCR检测,与空白对照组和FV040-control组比较,FV040-miR-186-sponge组EA.hy926细胞中miR-186相对表达水平降低(P<0.01).结论:成功构建了miR-186基因的海绵载体,建立了稳定下调miR-186表达的EA.hy926-miR-186-sponge细胞株.