过表达三突变型HIF--1α重组EA.hy926细胞株的构建及鉴定

摘要

目的:本研究构建过表达三突变型低氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)慢病毒载体并进行慢病毒包装，感染人脐静脉内皮细胞EA.hy926，使其过表达HIF-1α，并观察HIF-1α过表达对EA.hy926细胞增殖、周期及凋亡的影响，为后续研究HIF-1α基因与其辅助激活因子的调节机制奠定坚实的基础。 方法:1.以原有质粒pcDNA3.1+-HIF1-Ala402-Ala564-Ala803为模板，采用PCR扩增获取HIF-1α三突变基因片段，与pHS-BVC-B027质粒经NotⅠ/SpeⅠ限制性内切酶双酶切，再通过Gibson组装方法将酶切后的HIF-1α三突变基因片段与pHS-BVC-B027质粒连接形成带有目的基因片段的入门载体。通过Gateway技术中的LR结合反应，将含有HIF-1α三突变基因的入门载体与慢病毒相关的表达载体连接，构建重组三突变型HIF-1α慢病毒载体（PLV_CMV-HIF1a-2A-EGFP-2A-Puro）。慢病毒载体转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，经过挑选阳性克隆、摇菌、质粒提取等过程，将获得的质粒通过双酶切及测序方法鉴定载体构建是否正确。2.将重组三突变型HIF-1α慢病毒载体与慢病毒辅助包装质粒共转染人胚肾细胞系HEK293T细胞，包装慢病毒，收集病毒液。3.包装好的重组慢病毒感染人脐静脉内皮细胞EA.hy926，含1μg/ml嘌呤霉素的DMEM完全培养基筛选稳定表达HIF-1α的细胞株，在荧光显微镜下观察增强型绿色荧光蛋白(EGFP)表达情况，采用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)及蛋白免疫印迹法(Western blot)验证HIF-1α在EA.hy926细胞中的过表达情况。4.采用CCK8法检测HIF-1α过表达后细胞增殖的变化情况。5.采用流式细胞仪检测HIF-1α过表达后细胞周期及细胞凋亡的变化情况。 结果:1.酶切鉴定及基因测序结果都表明三突变型HIF-1α慢病毒载体(PLV CMV-HIF1a-2A-EGFP-2A-Puro)构建成功。 2.慢病毒载体与辅助包装质粒共转染HEK293T细胞48h后，成功包装出具有高效感染力的慢病毒，在荧光显微镜下观察到明显的EGFP表达。 3.慢病毒感染EA.hy926细胞并经过嘌呤霉素筛选后，在荧光显微镜下观察到大量EGFP表达，感染率达到80％以上。Real-time PCR结果显示，Lenti-HIF-1α组细胞HIF-1αmRNA的表达高于Lenti-negative组及WT组，差异具有统计学意义(P＜0.001)。Western blot结果显示，Lenti-HIF-1α组HIF-1α蛋白表达明显高于Lenti-negative组及WT组，差异具有统计学意义(P＜0.001)。 4.CCK8检测细胞增殖结果显示，细胞培养24、48、72h后，Lenti-HIF-1α组和Lenti-negative组相比，细胞增殖差异无统计学意义(P＞0.05)。 5.流式细胞仪检测细胞周期结果显示，Lenti-HIF-1α组和Lenti-negative组在G0/G1期差异无统计学意义（P＞0.05），而Lenti-HIF-1α组S+G2/M期的细胞明显少于Lenti-negative组，差异具有统计学意义(P＜0.05)。 6.流式细胞仪检测细胞凋亡结果显示，Lenti-HIF-1α组细胞凋亡率明显高于Lenti-negative组，差异具有统计学意义(P＜0.01)。 结论:1.成功构建重组三突变型HIF-1α慢病毒载体(PLV CMV-HIF1a-2A-EGFP-2A-Puro)。 2.成功构建过表达三突变型HIF-1α重组EA.hy926细胞株。 3.HIF-1α过表达在EA.hy926细胞中发挥着促凋亡的作用。