K-RAS基因6种突变型细胞株的构建与鉴定

摘要

K-RAS蛋白属于RAS蛋白家族中的一员，当EGFR或其他酪氨酸激酶受体在胞外信号分子刺激下激活后，RAS蛋白从与GDP结合的无活性形式转变成与GTP结合的有活性形式，继续激活RAF-MAPK及PI3K/AKT等信号通路，最终实现对细胞增殖、凋亡、代谢及血管生成的调节。突变的RAS基因导致RAS蛋白的GTP酶活性降低，使其处于与GTP结合的持续激活状态，从而使正常细胞发生恶性转化成并形成肿瘤。KRAS基因是结直肠癌中突变频率最高的基因，其不同的突变类型与结直肠癌的分期及预后相关。此外，KRAS突变与转移性结直肠癌治疗中抗表皮生长因子受体单克隆抗体（anti-EGFR mAb）的耐药性相关，然而其具体机制尚不明确。最近临床研究发现并非所有KRAS突变类型的生物学效应都相似，与第12密码子各种突变不同，G13D突变的转移性结直肠癌患者仍能从抗EGFR单抗的治疗中获益。该结果仍需体内外实验的进一步验证，并探究其发生机制。为了进一步研究KRAS基因上述突变在结直肠癌预后及治疗中的作用，构建稳定表达这些突变的结直肠癌细胞株成为首要任务。本研究通过构建野生型及G12D、G12V、G12A、G12S，G13D和Q61H共6种突变型KRAS重组慢病毒载体，并包装沉淀成慢病毒颗粒感染结肠癌细胞株CACO-2。经Pull down、Western blot实验及cDNA测序，证实感染后细胞稳定表达野生型及上述6种突变型KRAS基因。为进一步研究KRAS基因不同突变的生物学特性奠定了基础。
　　目的:构建野生型及6种突变型KRAS基因重组慢病毒载体，并包装沉淀慢病毒颗粒，感染结肠癌细胞株CACO-2，采用Pull down、Western blot实验及cDNA测序鉴定稳定转染细胞系。从而为下一步研究KRAS基因不同突变在结直肠癌治疗及预后中的作用提供重要的工具。
　　方法:
　　1.通过RT-PCR从人结肠癌细胞株CACO-2中扩增野生型KRAS基因，并将该基因连接到慢病毒表达载体。
　　2.以野生型KRAS基因为模板，利用定点突变PCR技术构建G12D、G12V、G12A、G12S，G13D和Q61H共6种突变型KRAS基因重组慢病毒载体。
　　3.经293T细胞包装沉淀慢病毒颗粒及滴度测定后，感染人结肠癌细胞株CACO-2，成功构建稳定表达野生型及上述6种突变型KRAS基因的细胞株。通过cDNA测序证实突变KRAS基因的表达，并根据突变型KRAS蛋白的持续激活状态经Pull down及Western blot实验证实其蛋白表达。
　　结果:经测序鉴定成功构建野生型KRAS基因重组慢病毒表达载体pCDF-KRAS-WT，通过定点突变PCR技术成功构建pCDF-KRAS-G12D、pCDF-KRAS-G12V、pCDF-KRAS-G12A、pCDF-KRAS-G12S、 pCDF-KRAS-G13D、pCDF-KRAS-G61H共6种突变型KRAS基因重组慢病毒载体。病毒载体包装沉淀成病毒颗粒感染CACO-2细胞后，经Pull down及Western blot实验及cDNA测序证实感染后的细胞株CACO-2-WT、CACO-2-G12D、CACO-2-G12V、CACO-2-G12A、CACO-2-G12S、CACO-2-G13D、CACO-2-G61H稳定表达野生型及上述6种突变型KRAS基因。
　　结论:成功构建了野生型及6种突变型KRAS基因重组慢病毒载体，包装沉淀成慢病毒颗粒并测定滴度后感染结肠癌细胞CACO-2，经鉴定成功构建稳定表达野生型及6种突变型KRAS基因的CACO-2细胞株。为进一步研究KRAS突变的在结直肠癌中的生物学特性提供了实验工具。

目录

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致谢

摘要

缩略词表

引言

1 实验材料

1．1 菌株、质粒和细胞株

1．2 实验仪器和设备

1．3 主要试剂

2 实验方法

2．1 KRAS野生型基因的克隆、慢病毒载体的构建及鉴定

2．2 KRAS基因6种突变慢病毒载体的构建及鉴定

2．3 重组慢病毒的包装和沉淀

2．4 慢病毒滴度测定

2．5 重组慢病毒感染CACO-2细胞

2．6 感染慢病毒后突变型KRAS蛋白的鉴定

2．7 感染慢病毒后突变型KRAScDNA的鉴定

3 实验结果

3．1 KRAS基因cDNA的扩增

3．2 重组慢病毒表达载体pCDF-KRAS-wT PCR验证

3．3 将pCDF-KRAS-WT质粒送上海英骏生物技术有限公司测序

3．4 突变型KRAS基因的构建

3．5 重组慢病毒的构建

3．6 重组慢病毒滴度测定

3．7 CACO-2细胞感染慢病毒

3．8 验证突变型KRAS蛋白表达

3．9 各稳转突变株KRAS cDNA测序

4 讨论

5 结论

参考文献

综述 奥沙利铂与西妥昔单抗联用的分子机制研究现状

个人简历及在学期间所取得的科研成果