健脾清化方改善局灶节段性肾小球硬化的效应机制研究

摘要

目的:探讨健脾清化方对局灶节段性肾小球硬化(FSGS)小鼠及阿霉素诱导足细胞损伤的保护作用,并观察其对炎症反应、氧化应激及细胞凋亡的影响。方法:(1)体内实验:实验组balb/c小鼠,采用单次尾静脉注射阿霉素(10.5 mg/kg)的方法建立FSGS动物模型,造模后连续灌胃给药6周。测定24 h尿蛋白(定量)、血肌酐,及肾组织内超氧化物歧酶、丙二醛、过氧化氢酶的水平。并采用H&E、Masson、PAS染色,观察肾组织病理损伤程度。透射电镜观察肾脏超微结构。免疫荧光nephrine/p-JAK2双染观察足细胞上p-JAK2的表达。免疫印迹法检测(western blotting,WB)肾组织中p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3、TGF-β1蛋白表达水平。(2)体外实验:实验1:采用CCK-8法检测阿霉素及健脾清化方对细胞活力的影响,并筛选出造模和健脾清化方干预浓度。DCFH-DA荧光探针检测各组足细胞ROS的含量。流式细胞术测定足细胞凋亡情况。WB检测p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3、TGF-β1的蛋白表达水平以及RT-qPCR检测STAT3下游凋亡因子BAX、BAD、Caspase3、p21、Blc-2、和炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α的mRNA表达情况。实验2:WB检测JAK2激动剂C-A1对p-JAK2/JAK2,p-STAT3/STAT3蛋白表达的影响。结果:(1)体内实验:与对照组相比,模型组小鼠肾小球硬化,足细胞足突广泛融合,肾组织p-JAK2荧光表达明显增加。24 h尿蛋白定量、血肌酐、MDA升高,SOD、CAT降低(P<0.05)。p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3、TGF-β1表达升高。与模型组相比健脾清化方干预后足细胞损伤缓解,肾组织P-JAK2荧光表达降低,24 h尿蛋白定量、血肌酐、MDA降低,SOD、CAT升高。p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3、TGF-β1表达降低(P<0.05)。(2)体外实验:实验1:CCK-8法确定阿霉素造模浓度为0.4μg/mL,健脾清化方干预低中高浓度分别为1 mg/mL,2 mg/mL,4 mg/mL。与对照组比较,模型组凋亡细胞数量、ROS含量增多,p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3、TGF-β1蛋白表达升高(P<0.05),BAX、BAD、Caspase3、p21、IL-6、TNF-α、IL-1β的mRNA表达降低,Blc-2 mRNA表达升高(P<0.05),与模型组比较,健脾清化方干预后,凋亡细胞数量、ROS含量减少,JAK2/STAT3、TGF-β1蛋白表达降低,BAX、BAD、Caspase3、p21、IL-6、TNF-α、IL-1β的mRNA表达升高,Blc-2的mRNA表达降低,且成量效关系(P<0.05)。实验2:与对照组相比,C-A1组p-JAK2/JAK2蛋白表达升高(P<0.05),与ADR+H组相比,ADR+H+C-A1组p-STAT3/STAT3蛋白表达升高(P<0.05)。结论:健脾清化方可通过抑制JAK2/STAT3信号通路,调节炎症反应、细胞凋亡、氧化应激从而延缓FSGS足细胞损伤的进展。