胎儿间充质干细胞cDNA扣除文库的构建

摘要

为了获得胎儿和成人间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)的差异表达基因,尤其是在胎儿MSC中特异表达的基因,应用抑制扣除杂交技术构建了胎儿和成人MSC cDNA扣除文库.首先,分别从胎儿和成人MSC中提取总RNA,按照SMART PCR方法依次合成单链和双链cDNA,经RsaI酶切后,胎儿MSC cDNA分别与两种不同的接头连接,再与成人MSC cDNA经过两次扣除杂交及两轮抑制性PCR扩增后,将产物与T载体连接构建成cDNA扣除文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增.结果:文库扩增后共获得890个克隆,对所获得的克隆进行PCR扩增鉴定,获得768个阳性克隆,阳性率为86.3%.插入片段大小分布在0.2-1kb,平均为400-600bp.结论:抑制扣除杂交技术是一种简便、有效的筛选差异表达基因的方法.胎儿MSC cDNA扣除文库的构建为进一步筛选、克隆胎儿MSC中特异性表达的功能相关基因奠定了基础.