凝血因子Ⅸ无义突变真核表达载体的构建及其在COS-7细胞的表达

摘要

本研究以含有fⅨcDNA的pcDNA3.1质粒为模板构建4种包含不同类型无义突变的fⅨ真核表达载体并进行鉴定,实现其在COS-7细胞中的表达.采用以PCR为基础的定点突变法体外构建fⅨ基因无义突变体,并通过DNA序列分析进一步鉴定证实;应用脂质体转化技术将野生型、突变型fⅨ表达载体分别瞬时转染COS-7细胞,采用实时定量PCR鉴定fⅨmRNA在各组的相对表达水平.结果表明,4个突变型质粒除相应位点的无义突变外,未见其它突变,提示无义突变载体构建成功.实时定量PCR鉴定表明,各突变组真核表达载体已成功转染COS-7细胞株并能转录为mRNA.结论:采用以PCR为基础的定点突变法可在体外构建fⅨ真核表达载体,并可在COS-7细胞中表达,其转录过程中不引发mRNA降解,这为进一步研究无义突变引起FⅨ功能丧失及表达量降低的机制和治疗研究提供了物质基础.