人MUC5AC基因启动子荧光素酶报告基因载体的构建及其转录活性分析

摘要

目的:克隆人黏蛋白/黏液素5AC(MUC5AC)基因启动子并构建该启动子的荧光素酶报告系统,探讨该启动子的活性及转录靶向性.方法:运用Vector NT1软件包对MUC5AC基因5'端1 348 bp进行启动子特征分析;以人A549细胞基因组DNA为模板分离出人MUC5AC基因5'端非翻译区大小为1 348 bp的片段并进行测序鉴定,再以扩增产物为模板对启动子进行5'端删除分析,分别扩增737 bp(-689/+48),372 bp(-324/+48),112 bp(-64/+48)的片段,与荧光素酶报告基因载体重组构建,通过双荧光素酶活性进行转录活性分析.应用定点突变技术,在重组质粒的基础上建立MUC5AC启动子区SP-l结合位点和核因子(NF)-κB结合位点单独突变体,并测定中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)诱导的转染细胞荧光素酶的相对活性.结果:序列分析发现人MUC5AC基因5'端1 348 bp的区域内存在多个顺式作用元件,成功构建了4个不同长度的MUC5AC启动子报告基因载体.双荧光素酶活性分析372 bp片段为有活性的最小片段.NE可诱导含有MUC5AC启动子区NF-кB结合位点单独突变体(pGL3E-MUC5AC-NF-кB-MU)荧光素酶相对光强度增加,而NE不能诱导SP-1结合位点单独突变体(pGL3E-MUC5AC-SP-1-MU)荧光素酶表达增加.结论:上述载体的成功构建及序列分析为进一步研究MUC5AC基因的启动子活性及基因表达调控奠定了基础.MUC5AC 5'上游序列中-324/-64位点存在参与NE诱导MUC5AC基因表达的重要调控元件,位于此区域的顺式作用元件SP-1位点在NE诱导MUC5AC基因表达机制中起重要作用.