心肌肌球特定基因-肌球蛋白轻链基因可在人脐带间充质干细胞诱导分化为心肌样细胞表达

摘要

目的:探讨人心肌肌球蛋白轻链(2v)基因启动子(pMLC2v)驱动的绿色荧光蛋白(GFP)和荧光素酶(Luc)报告基因慢病毒载体在人脐带间充质干细胞(hUCMSC)向心肌样细胞分化中的表达.方法:酶消化法原代分离培养hUCMSC,采用流式细胞仪鉴定分析其细胞表面标记物及检测体外向成骨细胞、成脂细胞、内皮细胞诱导分化潜能;经5-氮杂胞苷(5-Aza)诱导hUCMSC定向分化成心肌样细胞;诱导细胞并同时转染pMLC2v-GFP,于d3,d7,d10,d14,d17及d21时间点在荧光显微镜下观察及流式细胞仪检测其阳性率;用生物发光检测仪检测相同时间点的萤光素酶(pMLC2v-Luc)报告基因慢病毒载体转染分化细胞发光特征;在激光共聚焦显微镜下观察pMLC2v-GFP及红色荧光蛋白(RFP)共转染诱导21d后分化细胞蛋白的表达分布状况;与鼠心肌细胞作为对照,脉冲电流激发细胞收缩和细胞内及细胞间的钙离子流,以检测诱导分化细胞“兴奋-收缩”偶联功能;Western blot法检测诱导分化细胞pMLC2v蛋白的表达.结果:原代培养的P3 hUCMSC,经FCM检测CD90、CD105及CD73阳性率均为99％以上为高表达;获得的细胞分别经体外诱导能够向成骨细胞、成脂细胞、成内皮细胞分化;经5-氮杂胞苷(5-Aza)诱导hUCMSC同时并转染pMLC2v GFP,在荧光显微镜下观察并用流式仪检测GFP表达阳性细胞数随诱导时间的延长而增加(P＜0.05);生物发光检测仪检测诱导细胞pMLC2v-Luc表达同样呈阳性递增;pMLC2v GFP及RFPC共转染诱导21d后分化的细胞,细胞浆内形成较清晰的与细胞长轴平行的肌束样结构;诱导后的细胞用共聚焦显微镜检测无细胞内及细胞间的钙离子流动;随诱导时间的延长pMLC2v蛋白表达明显增加(P＜0.05).结论:在hUCMSC体外诱导形成心肌样细胞过程中,pMLC2v基因随诱导时间的延长而表达增加,为监测干细胞的移植在心肌疾病治疗中提供了实验依据.