牛支原体武威分离株eno基因的克隆、表达及酶活测定

摘要

牛支原体(Mycoplasma bovis,Mb)是引起肉牛(Bos taurus)和奶牛疾病的重要病原之一,给养牛业造成了重大的经济损失.烯醇化酶(enolase,eno)为糖酵解途径的关键限速酶,主要催化2-磷酸甘油酸转化为磷酸烯醇式丙酮酸.为研究Mb eno酶促活性及其动力学参数,本研究参照GenBank中Mb PG45株eno基因(NC_014760.1)序列设计特异性引物,应用PCR扩增获得Mb武威分离株的eno基因.在序列分析及基因优化的基础上,构建其原核表达载体pETeno并转化大肠杆菌(Escherichia coli)表达菌Transetta (DE3),经异丙基硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导表达,在十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl dulfate polyacrylamide gel electropheresis,SDS-PAGE)分析的基础上,纯化表达产物对其酶促活性进行分析.结果 表明,优化后的Mb武威株eno基因在大肠杆菌中成功获得表达,重组蛋白His-eno大小约为53 kD,且主要以可溶性蛋白形式存在;酶活分析结果显示:纯化产物His-eno的催化活性略高于兔肌肉烯醇化酶,且其最适温度为42℃,最适pH为8.0.双倒数作图所得His-eno米氏常数(Km)和最大反应速率(Vmax)分别为4.1×10-3 mol/L和3.4 μmol/(L-min).本研究结果为进一步研究Mb eno的生物学功能提供基础资料.