黑胸散白蚁体内产纤维素酶细菌的筛选及其纤维素酶基因的鉴定与原核表达

摘要

白蚁(Isoptera)常以富含纤维素的木材为食,体内存在纤维素酶产生菌.从源于陕西佛坪的白蚁(经鉴定为黑胸散白蚁(Reticulitermes chinensis))体内筛选出了4株产纤维素酶菌株,采用单因素实验设计对酶活最高的菌株进行了产酶条件优化,并对其所产纤维素酶进行了酶学性质研究;同时,依据NCBI数据库设计的引物扩增出了该菌株的内切-β-1,4-葡聚糖酶基因Cbs和β-葡萄糖苷酶基因BaG,之后在大肠杆菌(Escherichia coli)中进行了表达实验.结果表明:从黑胸散白蚁体内筛选出4株菌分别是阿氏肠杆菌(Enterobacter asburiae)、炭疽芽胞杆菌(Bacillus cereus)、枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens),其中枯草芽胞杆菌所产纤维素酶的活力最高,该菌发酵产酶的最适温度和pH分别是42℃、6.5,酶促反应的最适温度和pH分别是70℃、4.5,在此条件下该菌株酶活力为2.36 U/mL.该菌株所产的纤维素酶在50℃、pH 6.5的条件下热稳定性和pH稳定性最佳,使用该菌株所产的粗酶液发酵粗饲料,结果发现其对玉米(Zea mays)秸秆、小麦(Triticum aestivum)秸秆、苜蓿(Medicago polymorpha)干草和青贮饲料的粗纤维降解率分别为12.21％、1.3％、3.24％和17.42％.基因克隆结果表明该菌株具有BaG、Cbs2个纤维素酶基因,且大肠杆菌表达结果显示BaG基因的粗酶液proBaG无纤维素酶活性,而Cbs基因的粗酶液proCbs在60℃、pH 5.0时酶活可达4.14 U/mL,将BaG和Cbs基因进行原核融合表达,产生的蛋白约35kD,其在最适条件70℃、pH 4.5时的酶活为4.57 U/mL,说明无纤维素酶活性的BaG基因与Cbs基因融合后可能表达出了一个活性更高的纤维素酶蛋白.本研究对后期构建可降解木质纤维素的人工重组菌具有重要的理论价值.