白蚁体内产纤维素酶细菌的分离鉴定及其相关基因的载体构建与原核表达

摘要

木质纤维素的主要成分有木质素（约占总质量18-35%）、纤维素（约占总质量20-50%）和半纤维素（约占总质量15-35%），其中纤维素是由D-吡喃葡萄糖基通过β-1,4糖苷键连接而成的线性多聚糖，它是植物最重要的组成成分，约占植物总重量的20%-40%，是地球上最丰富的可再生聚合物，但是它在聚合物形式不能被动物机体直接利用。但白蚁体内存在大量可降解纤维素的微生物，能够高效利用富含木质纤维素的木材。。因此本研究从陕西省佛坪县采集白蚁样品，从白蚁体内筛选出产高活性纤维素酶的菌株，再克隆出其纤维素酶基因，并使该基因在大肠杆菌中表达，旨在为纤维素酶基因人工重组菌的构建提供理论技术与基础材料；之后通过构建乳酸杆菌表达载体，使纤维素酶基因在罗伊氏乳酸杆菌上表达并分泌，最后通过发酵试验检测重组菌株对粗饲料的降解效果。主要研究结果如下： 1. 采集得到的白蚁样品经过形态学和16s rRNA鉴定，最终确定其为黑胸散白蚁（Reticulitermes chinensis）。通过羧甲基纤维素钠培养基筛选以及刚果红染色的方法，从白蚁体内筛选出了4株高产纤维素酶的菌株，经鉴定其分别为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis strain）、阿氏肠杆菌（Enterobacter asburiae strain）、解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens strain）、苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis strain）。其中枯草芽孢杆菌所产的纤维素酶活性最高，该菌株发酵产酶的最适温度和pH分别为42℃和6.5，酶促反应的最适温度和pH分别为70℃、4.5，在此条件下该菌株的酶活力为2.36 U/mL。 2. 通过NCBI相关序列设计引物（序列编号：CP018173.1和KT992142.1），从枯草芽孢杆菌扩增出了两个纤维素酶基因：内切-β-1,4-葡聚糖酶基因Cbs和β-葡萄糖苷酶基因BaG，且在大肠杆菌表达结果显示BaG基因表达蛋白proBaG无纤维素酶活性，而Cbs基因表达蛋白proCbs在60℃、pH 5.0条件下酶活可达4.14 U/mL，将纤维素酶基因Cbs和BaG进行原核融合表达，产生的蛋白分子量大小约为35 kDa，其在最适条件70℃、pH 4.5时的酶活为4.57 U/mL，说明无纤维素酶活性的BaG基因与Cbs基因融合表达出了一个活性更高的纤维素酶蛋白。 3. 通过酶切连接的方法将Cbs2基因与乳酸杆菌组成型启动子（P32)、信号肽（SPlpo373）基因共同连接于pLEM-415载体，成功获得表达和分泌内切葡聚糖酶的载体，将该载体在罗伊氏乳酸杆菌表达和分析发现：重组菌株的最佳产酶时间和温度分别为21 h、37℃，在最佳产酶条件下所产内切葡聚糖酶的羧甲基纤维素酶活性（CMCase）为3.0 U/mL，分子量约为55 kDa，酶促反应的最适温度和pH分别为60-70℃、5.5，在pH 5.5、50-60℃条件下该酶具有最佳的稳定性，金属离子Mn2+、Mg2+对酶促反应有较高的促进作用；而Zn2+、Fe2+、Ba2+、EDTA对该酶均有较强的抑制作用。 4. 使用重组菌株对粗饲料进行发酵，结果表明重组菌株对玉米秸秆、小麦秸秆、苜蓿干草均有一定的降解作用，与野生菌株发酵结果相比，3种粗饲料粗纤维含量分别降低了12.02±1.23%、5.66±1.23%、11.75±0.90%。 综上所述，本研究从黑胸散白蚁体内筛选出4株产纤维素酶的菌株，其中酶活最高的菌株是枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis strain），其纤维素酶活性为2.36 U/mL。继而，从该株枯草芽孢杆菌体内扩增出了2个纤维素酶基因，其中内切葡聚糖酶的最高活性为4.14 U/mL，而β-葡萄糖苷酶却无活性，可是，经过两个纤维素酶基因的融合表达，可产生一个酶活性更高的蛋白。发酵试验表明，本试验构建的重组乳酸杆菌的CMCase为3.0 U/mL，对粗饲料具有一定的较为明显的降解效果。

目录

第一章 纤维素酶及其来源生物研究进展

1.1 纤维素分子结构和降解方法

1.2 纤维素酶的分子研究

1.3 产纤维素酶的生物研究

1.4 纤维素酶研究现状和展望

1.5 本研究的目的和意义

第二章 白蚁种属及其产纤维素酶细菌的分离鉴定

2.1 材料

2.2 方法

2.3 结果与分析

2.4 讨论

2.5 小结

第三章 纤维素酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

3.1 材料

3.2 方法

3.3 结果与分析

3.4 讨论

3.5 小结

第四章 表达纤维素酶重组乳酸杆菌的构建

4.1 材料

4.2 方法

4.3 结果与分析

4.4 讨论

4.5 小结

第五章 重组乳酸杆菌对粗饲料的发酵效果研究

5.1 材料

5.2 方法

5.3 结果与分析

5.4 讨论

5.5 小结

第六章 结论、创新点以及需要进一步研究的问题

6.1 结论

6.2 创新点

6.3 需要进一步研究的问题

参考文献

附录

附录1 应用滤袋技术测定粗纤维洗涤（CF）的方法

附录2 细菌基因组DNA提取方法

附录3 制备大肠杆菌DH 5α感受态细胞

附录4 制备罗伊氏乳酸杆菌感受态细胞方法

附录5 化学转化至大肠杆菌方法

附录6 化学转化至大肠杆菌方法

附录7 TAKARA切胶回收方法

附录8 TAKARA pMD19-T载体使用方法

附录9 基因序列

附录10 酶活计算方法

致谢

作者简介