重组质粒pGMLV-SC1RNAi的构建及其对猪卵巢颗粒细胞c-Fos的影响

摘要

目的 构建慢病毒载体及观察其介导的RNA干扰猪卵巢颗粒细胞c-Fos基因表达情况.方法 通过在线软件设计猪c-Fos基因shRNA序列,合成、退火形成双寡链核酸后克隆到PGMLV-SC1载体,测序.用构建的慢病毒表达载体和包装质粒共转染293T细胞,包装成4组病毒(shRNA c-Fos1、shRNA c-Fos2、shRNA c-Fos3、shRNA c-Fos4),并测定滴度.感染猪卵巢颗粒细胞,采用PCR和Western blot检测各组细胞c-Fos mRNA和蛋白表达.结果 重组克隆中插入片段序列与设计的Oligo序列完全一致.滴度为1×108 TU/mL,感染复数30时,阴性对照组、实验shRNA c-Fos4、shRNA c-Fos3、shRNA c-Fos2、shRNA c-Fos1组c-Fos mRNA的表达分别为对照组的0.842 7±0.065 6、0.797 6±0.073 8、0.694 1±0.048 9、0.653 7±0.047 0、0.312 3±0.010 6倍(P<0.05),c-Fos蛋白的表达下降.结论 实验shRNA c-Fos1组c-Fos基因下调最明显,成功构建猪卵巢颗粒细胞c-Fos基因慢病毒RNAi表达载体并筛选出最佳siRNA序列.为c-Fos基因的功能研究提供了研究基础.