EGCG对人食管癌ECa109细胞生长凋亡及其p16基因甲基化状态、mRNA和蛋白表达水平的影响

摘要

目的 探讨表没食子儿茶素食子酸酯(EGCG)对人食管癌ECa109细胞生长及凋亡的作用,并检测其对ECa109细胞中p16基因甲基化状态、mRNA和蛋白表达水平的影响.方法 以0、25、50、100、200 mg/L浓度的EGCG分别作用于食管癌ECa109细胞24、48、72、96 h后,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测ECa109细胞吸光度值,观察细胞存活率;用流式细胞术测定不同浓度EGCG处理后的细胞凋亡率,甲基化特异性PCR (MSP)检测抑癌基因p16在不同药物浓度下的甲基化状态,实时荧光定量PCR(FQ-PCR)检测基因p16 mRNA的表达,并用免疫印迹法Western blot检测p16蛋白的表达情况.结果 EGCG处理食管癌ECa109细胞后,MTT法测得细胞存活率随着EGCG浓度和作用时间的增加而降低,各浓度间比较差异有统计学意义(P＜0.05).流式细胞仪凋亡检测显示,在96 h时25、50、100、200 mg/L EGCG处理的细胞凋亡率分别为9.98％、15.60％、19.40％、27.20％,与0 mg/L(0.21％)处理比较,差异有统计学意义(P＜0.05).MSP法显示,p16基因在未加药组(0 mg/L)为高甲基化状态,EGCG处理食管癌ECa109细胞96 h后,25 mg/L组p16基因仍为甲基化,而50 mg/L组出现部分甲基化,100、200 mg/L组表现为去甲基化状态.FQ-PCR法测得25、50、100、200 mg/L组p16基因mRNA相对表达量分别是1.18±0.43、1.29±0.11、1.52±0.74、1.67±0.37,与0 mg/L组(1.00±0.00)比较差异有统计学意义(P＜0.05).Western blot结果显示,EGCG处理细胞96 h后,0、25 mg/L组p16蛋白为无表达,50、100、200 mg/L组恢复表达.结论 EGCG可明显抑制ECa109细胞增殖,诱导ECa109细胞凋亡,且具有明显的剂量和时间依赖性;EGCG可使ECa109细胞中p16基因去甲基化,增加其mRNA和蛋白表达;EGCG可能通过逆转p16基因高甲基化抑制食管癌ECa109细胞.