HPLC-荧光法测定醛糖还原酶的活性

摘要

10.3969/j.issn.1001-1978.2012.10.033%　　目的建立一种基于NADP+衍生物荧光的高灵敏度的体外测定醛糖还原酶(aldose reductase, AR)活性的HPLC方法.方法从大鼠的肾脏中分离纯化AR,以DL-甘油醛为底物,加入NADPH启动酶促反应.以C18柱分离NADP衍生物,流动相为乙腈∶水(75∶25),流速1畅0 ml・ min柱温25℃,荧光检测激发波长370 nm,发射波长465 nm.测定NADP+衍生物的稳定性以及NADPH、DL-甘油醛、pH、温度对AR活性的影响.结果 NADP+衍生物稳定性好,保留时间为(1畅4±0畅01) min,附近无干扰峰,其浓度与荧光强度线性关系良好(r=0畅9994),最低检测限为25 pmol.日内和日间精密度均小于10%.结论本方法操作简单、灵敏度高、特异性强,可用于体外AR的活性的测定.+-1