SARS冠状病毒M蛋白全长基因的克隆、表达与纯化

摘要

目的克隆SARS冠状病毒M蛋白基因编码序列, 构建原核重组表达质粒pET23a-M, 并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达、纯化.表达产物用Western Blot检测其抗原性.方法 RT-PCR 扩增M编码基因目的片段, 胶回收纯化, 插入克隆载体pMD-18T载体并转化大肠杆菌DH5α.序列测定后亚克隆至表达质粒载体pET23a, 构建重组体pET23a-M,转化大肠杆菌DH5α.筛选阳性克隆,以限制性酶切分析鉴定后,转化大肠杆菌BL21(DE3)以异丙基硫代半乳糖苷(IPTG) 进行诱导表达.用SDS-PAGE与免疫印迹分析表达产物.结果 PCR扩增出约675bp的特异性片段,与预期片段大小相符,测序鉴定无有义突变;所构建的pET23a-M 重组体阳性克隆经PCR与双酶切鉴定,与预期结果一致;SDS-PAGE显示表达产物约27kD;表达产物经金属螯和层析纯化;免疫印迹表明表达产物能被混合的SARS病人恢复期血清识别.结论成功克隆了SARS冠状病毒M蛋白基因编码序列,构建了pET23a-M 表达质粒,诱导表达并纯化出了SARS冠状病毒M蛋白,并以免疫印迹鉴定.本研究的成功为进一步进行SARS病毒诊断试剂与疫苗的开发奠定了基础.