抑制SARS冠状病毒M蛋白基因表达的小干扰RNA及其编码基因与应用

摘要

本发明公开了抑制SARS冠状病毒M蛋白基因表达的小干扰RNA及其编码基因与应用。该抑制SARS冠状病毒M蛋白基因表达的小干扰RNA，是下述1)和2)中的至少一个双链RNA序列：1)正义链具有序列表中序列1的核苷酸序列，反义链具有序列表中序列2的核苷酸序列；2)正义链具有序列表中序列3的核苷酸序列，反义链具有序列表中序列4的核苷酸序列。本发明将在制备以抑制SARS冠状病毒M蛋白基因表达的小干扰RNA或携带所述抑制SARS冠状病毒M蛋白基因表达的小干扰RNA编码基因的表达载体为活性成分的药物中发挥重要作用。

说明书

技本领域

本发明涉及小干扰RNA及其编码基因与应用，特别是涉及抑制SARS冠状病毒M 蛋白基因表达的小干扰RNA及其编码基因与其在制备SARS治疗性药物中的应用。

背景技术

严重急性呼吸道综合征(Severe Acute Respiratory Syndrome，SARS)是一种严 重威胁人类健康甚至生命的传染性疾病。引起SARS的病原体SARS-CoV为一种新型的冠 状病毒，具有棘突蛋白S(spike)，基质蛋白M(matrix)，包膜蛋白E(Envelope) 和核蛋白N(Nuclear protein)等数种主要结构蛋白(Holmes KV.SARS-associated coronavirus.N Engl J Med，2003，348(20)：1948-51.)。其中，M蛋白是包膜中的 主要结构蛋白，可能与病毒的组装和细胞内出芽有关，在病毒感染中起到重要作用。 目前，尚未有直接而有效的治疗SARS-CoV的方法。

RNA干扰技术(RNA interference，简称RNAi)是在小双链RNA(dsRNA)分子的 介导下特异性降解靶基因的生物技术，能使基因表达沉默，达到拮抗靶基因功能的作 用，因而，具有很好的生物(基因)治疗潜力。长度为21-22nt的小干扰RNA(siRNA， small interfering RNA)介导特异性干扰反应，只降解与其长度互补的特定基因的 mRNA(Elbashir，S.M.，Harborth，J.，Lendeckel，W.et al.，Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature，2001，411(6836)：494)。RNAi技术因其在疾病治疗方面具有巨大潜力而 备受关注。RNA干扰技术为系统地抑制RNA分子合成蛋白提供了快速而相对简便的途 径，从而为疾病的防治提供了重要思路。迄今为止，有关siRNA可诱导产生针对SARS 病毒基因RNA的干扰效应，从而使该病毒的复制和蛋白表达受到抑制，对细胞形成保 护作用的报道已有多篇，但针对SARS-CoV M蛋白基因设计的利用载体发挥作用的 siRNA却少有报道。

发明内容

本发明的目的是提供载体靶向的抑制SARS冠状病毒M蛋白基因表达的小干扰 RNA。

本发明所提供的抑制SARS冠状病毒M蛋白基因表达的小干扰RNA，是下述双链 RNA序列之一：

1)正义链为序列表中的序列1，反义链为序列表中的序列2的双链RNA序列；

2)正义链为序列表中的序列3，反义链为序列表中的序列4的双链RNA序列。

将具有1)的双链RNA序列命名为siRNA-M1，其反义链与SARS-CoV M mRNA(GenBank 号：52100973)的220-241位置序列5’-gggugacuggcgggauugcgau-3’互补。序列表 中序列1由22个碱基组成，序列的方向从左至右为5′端→3′端；序列表中序列2 由22个碱基组成，序列的方向从左至右为5′端→3′端。

将具有2)的双链RNA序列命名为siRNA-M2，其反义链与SARS-CoV M mRNA的 460-480位置序列5’-gggcgcugugacauuaaggac-3’互补。序列表中序列3由21个碱 基组成，序列的方向从左至右为5′端→3′端；序列表中序列4由21个碱基组成， 序列的方向从左至右为5′端→3′端。

上述抑制SARS-CoV M蛋白基因表达的小干扰RNA分子的编码基因可具有下述1) 和2)中至少一个双链核苷酸序列：

1)有义链(正义链)(不做模板的DNA链)具有序列表中序列5的核苷酸序列 或在高严谨条件下可与序列表中序列5限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；反义链(做 模板的DNA链)具有序列表中序列6的核苷酸序列或在高严谨条件下可与序列表中序 列6限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；

2)有义链(正义链)(不做模板的DNA链)具有序列表中序列7的核苷酸序列 或在高严谨条件下可与序列表中序列7限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；反义链(做 模板的DNA链)具有序列表中序列8的核苷酸序列或在高严谨条件下可与序列表中序 列8限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

所述高严谨条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃ 下杂交并洗膜。

将具有1)的双链寡核苷酸序列编码基因命名为siDNA1，编码siRNA-M1。序列表 中序列5由56个碱基组成，序列的方向从左至右为5′端→3′端；序列表中序列6 由60个碱基组成，序列的方向从左至右为3′端→5′端。

将具有2)的双链寡核苷酸序列编码基因命名为siDNA2，编码siRNA-M2。序列表 中序列7由54个碱基组成，序列的方向从左至右为5′端→3′端；序列表中序列8 由58个碱基组成，序列的方向从左至右为3′端→5′端。

含有上述抑制SARS-CoV M蛋白基因表达的小干扰RNA编码基因的表达载体及由 此产生的siRNA，转基因动物、细胞系和宿主菌均属于本发明的保护范围。

本发明提供的小干扰RNA可对SARS冠状病毒M蛋白基因的表达产生干扰效应， 干扰效率可达70％以上，且随着含有siRNA-M1(或siRNA-M2)编码基因的RNAi干扰 载体的转染量的增加，SARS-CoV M蛋白的表达量逐渐下降，表明针对SARS-CoV M蛋 白设计的siRNA可显著抑制SARS-CoV M蛋白的表达，并具有剂量效应，从而为SARS冠 状病毒M蛋白的功能研究奠定了基础，为进一步研究SARS-CoV M蛋白在SARS-CoV的 致病机制中的作用提供了新的平台，对于揭示SARS的致病机制具有重要意义，同时 也为预防和治疗SARS及其相关疾病提供了新的思路和方法。本发明将在SARS的特异 性预防和治疗中具有潜在的应用价值，特别是在制备以抑制SARS冠状病毒M蛋白基 因表达的小干扰RNA或携带所述抑制SARS冠状病毒M蛋白基因表达的小干扰RNA编 码基因的表达载体为活性成分的药物中将发挥重要作用。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

附图说明

图1为抑制SARS-CoV M蛋白基因表达的小干扰RNA靶向序列在SARS-CoV M基因 序列中的位置示意图

图2为抑制SARS-CoV M蛋白基因表达的RNAi干扰载体的工作原理示意图

图3A为siRNA-M1对SARS-CoV M蛋白基因mRNA表达水平抑制作用剂量效应的 RT-PCR检测结果

图3B为siRNA-M1对SARS-CoV M蛋白基因mRNA表达水平抑制作用剂量效应的半 定量分析结果

图4A为siRNA-M2对SARS-CoV M蛋白基因mRNA表达水平抑制作用剂量效应的 RT-PCR检测结果

图4B为siRNA-M2对SARS-CoV M蛋白基因mRNA表达水平抑制作用剂量效应的半 定量分析结果

图5为siRNA-M1转染组的荧光强度检测结果

图6为siRNA-M2转染组的荧光强度检测结果

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见： 《Molecular Cloning：A Laboratory Manual》(Sambrook，J.，Russell，David W.， Molecular Cloning：A Laboratory Manual，3^rd edition，2001，NY，Cold Spring Harbor)。所用引物及DNA序列均由上海生工合成。

实施例1、抑制SARS-CoV M蛋白基因表达的小干扰RNA的设计和RNAi干扰载体 的构建

一、抑制SARS-CoV M蛋白基因表达的小干扰RNA的设计

按下述方法设计抑制SARS-CoV M蛋白基因表达的小干扰RNA：

根据SARS-CoV M基因mRNA序列(GenBank号：52100973)，以及pBS/U6载体(Sui GC et al.PNAS.2002 April；99(8)：5515-5520)中U6启动子的特殊要求，选取位 于SARS-CoV M基因mRNA序列转录起始位点aug下游220和460bp处的两段长度分别 为22bp和21bp的序列(靶向序列在SARS-CoV M基因序列中的位置示意图见图1)，避 开了不同病毒株之间的突变点，同时，所选取的这两段序列均以GGG起始，GC含量为 63.6％和57.1％，并将选取的序列进行了同源性比对分析以保证所筛选的抑制 SARS-CoV M蛋白基因表达的siRNA序列同除SARS-CoV外的其它种属序列无同源性， 将用上述方法获得的两对抑制SARS-CoV M蛋白基因表达的小干扰RNA分别命名为 siRNA-M1(序列表中序列1和序列2)和siRNA-M2(序列表中序列3和序列4)，siRNA-M1 作用于SARS-CoV M mRNA的220-241位置序列5’-gggugacuggcgggauugcgau-3’， siRNA-M2作用于SARS-CoV M mRNA的460-480位置序列

5’-gggcgcugugacauuaaggac-3’。

二、抑制SARS-CoV M蛋白基因表达的RNAi干扰载体的构建

1、根据siRNA-M1和siRNA-M2所作用的靶序列以及载体pBS/U6的使用要求，设 计能够产生siRNA-M1和siRNA-M2的siDNA序列，分别命名为siDNA1和siDNA2，具 体序列如下(下划线碱基序列为针对SARS-CoV M mRNA的靶序列)：

siDNA1正义链：

5’-gggtgactggcgggattgcgata agcttatcgcaatcccgccagtcaccctttttg -3’(序列5)

siDNA1反义链：

3’-cccactgaccgccctaacgctattcga atagcgttagggcggtcagtgggaaaaacttaa-5’(序列6)

siDNA2正义链：

5’-gggcgctgtgacattaaggaca agcttgtccttaatgtcacagcgccctttttg-3’(序列7)

siDNA2反义链：

3’-cccgcgacactgtaattcctgttcga acaggaattacagtgtcgcgggaaaaacttaa-5’(序列8)

2、根据所设计的siDNA1和siDNA2序列合成8条寡核苷酸，序列如下：

1a：5’-gggtgactggcgggattgcgata-3’

1b：3’-cccactgaccgccctaacgctattcga-5’

2a：5’-agcttatcgcaatcccgccagtcaccctttttg-3’

2b：3’-atagcgttagggcggtcagtgggaaaaacttaa-5’；

1a’：5’-gggcgctgtgacattaaggaca-3’

1b’：3’-cccgcgacactgtaattcctgttcga-5’

2a’：5’-agcttgtccttaatgtcacagcgccctttttg-3’

2b’：3’-acaggaattacagtgtcgcgggaaaaacttaa-5’

将上述8条两两互补的寡核苷酸片断经煮沸5分钟后自然冷却使之缓慢退火得到 1a1b和2a2b，1a’1b’和2a’2b’两对双链dsDNA(即四条双链dsDNA)。对含有U6启 动子的载体pBS/U6进行以下操作：用限制性内切酶Apa I和Kpn I分别进行双酶切，将 退火后的寡核苷酸双链1a1b克隆入经酶切回收的载体pBS/U6中，将含有1a1b的载体命 名为pBS/U6+1a1b，将含有1a’1b’的载体命名为pBS/U6+1a’1b’。再将2a2b克隆 入分别经限制性内切酶Hind III和EcoR I进行双酶切后的载体pBS/U6+1a1b中，得到 以5’-gggugacuggcgggauugcgau-3’为靶序列的SARS-CoV M蛋白基因的RNAi载体，将 其命名为pBS/U6-sim1；将2a’2b’用同样方法克隆入载体pBS/U6+1a’1b’中，得 到以5’-gggcgcugugacauuaaggac-3’为靶序列的SARS-CoV M蛋白基因的RNAi载体， 将其命名为pBS/U6-sim2。对pBS/U6-sim1和pBS/U6-sim2分别用限制性内切酶Xho I和 EoR V进行酶切鉴定(以空载体pBS/U6为对照)，结果空载体pBS/U6经双酶切可以释 放长度约为3200bp左右的DNA片段，而构建的载体pBS/U6-sim1和pBS/U6-sim2因插入 dsDNA使限制酶切位点缺失而不能释放该长度约为3200bp左右的DNA片段，与预期结果 相符，表明正确构建了分别含有siDNA1和siDNA2抑制SARS-CoV M蛋白基因表达的RNAi干 扰载体，其工作原理示意图如图2所示(A)为线性化的pBS/U6-sim：pBS/U6-sim以U6 作为启动子，启动子之后紧接着GGG作为小RNA的转录起始位点；B)为插入到 pBS/U6-sim中的寡核苷酸双链1a1b和2a2b；C)为寡核苷酸片段1a和2a被转录后形成 发夹状结构的siRNA，对目的基因发挥干扰效应。U6：U6启动子；Amp^r：氨苄青霉素抗 性基因；Pamp1和Pamp2：Amp^r扩增引物)。

实施例2、检测siRNA-M1和siRNA-M2对SARS-CoV M蛋白基因表达抑制的剂量效 应

一、含有SARS-CoV M蛋白基因的表达载体pCMV-Myc-M的构建

以SARS-CoV M蛋白基因为模板，在引物P1：5’-tatagaattctggcaacggtactatt-3’ 和P2：5’-tataggtaccgtcacttactgtactagcaaagc-3’的引导下PCR扩增SARS-CoV M蛋白 基因的cds区(编码序列)，并在序列两端分别添加上限制性内切酶Hind III和BamH I 识别位点，反应结束后对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果得到了大小 约为670bp的DNA片段，回收并纯化该目的片段，然后用限制性内切酶Hind III和BamH I对该目的片段进行双酶切后与经相同酶双酶切的真核表达载体pCMV-Myc(购自BD Biosciences公司)进行连接，得到SARS-CoV M蛋白基因的亚克隆载体，命名为 pCMV-Myc-M。

二、检测siRNA-M1和siRNA-M2对SARS-CoV M蛋白基因表达抑制的剂量效应

1、人胚肾细胞系293的培养

将人胚肾细胞系293培养于添加有体积百分浓度为10％的经热灭活的胎牛血清 (FBS)的Modified Eagle’s medium(MEM)培养基中，然后将293细胞以2×10⁵/孔的 密度培养于6孔板中，将细胞置于37℃，含5％CO₂的培养箱中进行培养至细胞密度达80 ％。

2、共转染

将实施例1构建的抑制SARS-CoV M蛋白基因表达的RNAi干扰载体pBS/U6-sim1和 pBS/U6-sim2以不同剂量(pCMV-Myc-M与干扰载体的质量比分别为：1∶1、1∶2、1∶ 4、1∶8)分别与步骤一构建的SARS-CoV M蛋白基因的表达载体pCMV-Myc-M用磷酸钙 法瞬时共转染步骤1培养的293细胞，对照组不加干扰载体，再将转染细胞培养48小时。

3、siRNA-M1和siRNA-M2对SARS-CoV M蛋白基因表达抑制剂量效应的RT-PCR检测 及半定量分析

收集293细胞，用RT-PCR的方法检测siRNA-M1、siRNA-M2对SARS-CoV M蛋白基因 表达抑制的剂量效应，具体方法为：利用Trizol(Invitrogen)提取转染细胞的总RNA， 然后取提取的2μg总RNA为模板用AMV反转录酶(Promage公司)反转录合成其cDNA， 再以该cDNA为模板，在引物P3：5’-tatagaattctggcagacaacggtactatt-3’和P4： 5’-tataggtaccgtcacttactgtactagcaaagc-3’的引导下PCR扩增SARS-CoV M蛋白基 因，PCR反应条件为：先94℃变性30秒，然后56℃退火1分钟，最后72℃延伸1分30秒。 同时以三磷酸甘油醛脱氢酶基因(GAPDH)片段作为PCR反应的内参，所用引物序列为： P5(上游引物)：5’-ggcaaagtggacattgtcgc-3’和P6(下游引物)：5’-agaag cagggatgatgttctgg-3’，反应条件不变。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂 糖凝胶电泳检测并对SARS-CoV M蛋白基因的表达水平进行半定量鉴定。

siRNA-M1对SARS-CoV M蛋白基因表达水平干扰剂量效应的RT-PCR检测检测结果 如图3A所示，内参GAPDH基因的转录水平基本一致，实验组SARS-CoV M蛋白基因的 表达量与对照组相比明显降低，且随着干扰载体pBS/U6-sim1转染剂量的增大(从左 至右)，SARS-CoV M蛋白基因的mRNA表达水平逐渐降低。siRNA-M1对SARS-CoV M 蛋白基因表达水平干扰剂量效应半定量分析结果如图3B所示(横轴：质粒pCMV-Myc-M 与pBS/U6-sim1的质量比，5个点分别为无干扰，1∶1，1∶2，1∶4，1∶8；纵轴：各组 RT-PCR跑胶后用紫外分光光度仪分析各条带亮度得到的数值)，siRNA-M1干扰组亮 度数值分别为82200(对照)，72026(1∶1)，63724(1∶2)，52656(1∶4)，32776 (1∶8)，而各组相应的内参亮度数值分别为72026，72213，74067，78409，76652。 上述检测结果表明与对照组相比，本发明的siRNA-M1对SARS-CoV M蛋白基因在细胞 中的表达具有较显著的抑制作用，其干扰效应可达70％以上，且随着siRNA-M1转染 量的提高，抑制作用也更加显著，呈现出明显的剂量效应，同时本发明的小干扰RNA 对细胞的生长无影响，证明无毒性作用。

siRNA-M2对SARS-CoV M蛋白基因表达水平干扰剂量效应的RT-PCR检测检测结果 如图4A所示，内参GAPDH基因的转录水平基本一致，实验组SARS-CoV M蛋白基因的 表达量与对照组相比明显降低，且随着干扰载体pBS/U6-sim2转染剂量的增大(从左 至右)，SARS-CoV M蛋白基因的mRNA表达水平逐渐降低。siRNA-M2对SARS-CoV M 蛋白基因表达水平干扰剂量效应半定量分析结果如图4B所示(横轴：质粒pCMV-Myc-M 与pBS/U6-sim2的质量比，5个点分别为无干扰，1∶1，1∶2，1∶4，1∶8；纵轴：各组 RT-PCR跑胶后用紫外分光光度仪分析各条带亮度得到的数值)，siRNA-M2干扰组亮 度数值分别为75682(对照)，62784(1∶1)，61754(1∶2)，43016(1∶4)，7732 (1∶8)，而各组相应的内参亮度数值分别为97578，91032，98567，102981，83904。 上述检测结果表明与对照组相比，本发明的siRNA-M2对SARS-CoV M蛋白基因在细胞 中的表达也具有较显著的抑制作用，其干扰效应可达70％以上，且随着siRNA-M2转 染量的提高，抑制作用也更加显著，呈现出明显的剂量效应，同时本发明的小干扰RNA 对细胞的生长无影响，证明无毒性作用。

实施例3、检测siRNA-M1和siRNA-M2对SARS-CoV M蛋白基因表达抑制的特异性

一、含有SARS-CoV M蛋白基因的表达载体pCMV-Myc-M的构建

用与实施例2相同的方法PCR扩增SARS-CoV M蛋白基因的cds区，并在序列两端分 别添加上限制性内切酶HindIII和BamH I识别位点，反应结束后对PCR扩增产物进行1 ％琼脂糖凝胶电泳检测，结果得到了大小约为670bp的DNA片段，回收并纯化该目的片 段，然后用限制性内切酶Hind III和BamH I对该目的片段进行双酶切后与经相同酶双 酶切的含有绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)基因的真核表达载体 pEGFP-N1(购自BD Biosciences公司)进行连接，得到SARS-CoV M蛋白基因的亚克隆 载体，命名为pEGFP-N1-M。

二、检测siRNA-M1和siRNA-M2对SARS-CoV M蛋白基因表达抑制的特异性

1、人胚肾细胞系293的培养

用与实施例1相同的方法对人胚肾细胞系293进行培养。

2、共转染

将实施例1构建的抑制SARS-CoV M蛋白基因表达的RNAi干扰载体pBS/U6-sim1和 pBS/U6-sim2按质量比1∶4分别与步骤一构建的SARS-CoV M蛋白基因的表达载体 pEGFP-N1-M用磷酸钙法瞬时共转染步骤1培养的293细胞，对照组共转染有仅含红色荧 光蛋白(green fluorescent protein，RFP)基因的载体pDsRed-N1(购自BD Biosciences公司)和pBS/U6-sim1(或pBS/U6-sim2，质量比仍为1∶4)，同时以 pEGFP-N1-M转染组作为SARS-CoV M蛋白基因表达量的参照，以含红色荧光蛋白RFP基 因的载体转染组作为RFP基因表达量的参照，再将转染细胞培养48小时。

3、siRNA-M1和siRNA-M2对SARS-CoV M蛋白基因表达抑制的特异性检测

将SARS-CoV M蛋白基因克隆到pEGFP-N1中，可表达SARS-CoV M蛋白与GFP形 成的融合蛋白，该融合蛋自因为携带有GFP而发出绿色荧光，因此将构建的融合蛋白 表达载体pEGFP-N1-M与pBS/U6-sim1(或pBS/U6-sim2)共转染293细胞后，若干扰 载体携带的小干扰RNA对SARS-CoV M蛋白基因的表达具有抑制作用，则绿色荧光蛋 白GFP基因的表达将受到抑制，荧光强度将会降低。

siRNA-M1转染组的荧光强度检测结果如图5所示(图a)为pEGFP-N1-M转染组 的观察结果；图b)为pEGFP-N1-M与pBS/U6-sim1共转染组的观察结果；c)红色荧 光蛋白RFP基因表达载体转染组：d)红色荧光蛋白RFP基因表达载体与pBS/U6-sim1 共转染组)，与pEGFP-N1-M转染组相比，pEGFP-N1-M与pBS/U6-sim1共转染组的绿 色荧光强度显著降低，而红色荧光强度组间无明显差别，表明pBS/U6-sim1所携带的 siRNA-M1对转入的外源SARS-CoV M蛋白基因表达具有显著，而且特异性地抑制作用， 可用于制备SARS的治疗性药物的研究。

siRNA-M2转染组的荧光强度检测结果如图6所示(图a)为pEGFP-N1-M转染组 的观察结果；图b)为pEGFP-N1-M与pBS/U6-sim2共转染组的观察结果；c)红色荧 光蛋白RFP基因表达载体转染组：d)红色荧光蛋白RFP基因表达载体与pBS/U6-sim2 共转染组)，与pEGFP-N1-M转染组相比，pEGFP-N1-M与pBS/U6-sim2共转染组的绿 色荧光强度显著降低，而红色荧光强度组间无明显差别，表明pBS/U6-sim2所携带的 siRNA-M2对转入的外源SARS-CoV M蛋白基因表达也具有显著，而且特异性地抑制作 用，同样可用于制备SARS的治疗性药物。

序列表

<160>8

<210>1

<211>22

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

gggugacugg cgggauugcg au

                                                                     22

<210>2

<211>22

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

aucgcaaucc cgccagucac  cc                                            22

<210>3

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

gggcgcugug acauuaagga c                                              21

<210>4

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>4

guccuuaaug ucacagcgcc c                                              21

<210>5

<211>56

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>5

gggtgactggcgggattgcgata agcttatcgcaatcccgccagtcaccctttttg            56

<210>6

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>6

cccactgacc gccctaacgc tattcgaata gcgttagggc ggtcagtggg aaaaacttaa    60

<210>7

<211>54

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>7

gggcgctgtg acattaagga caagcttgtc cttaatgtca cagcgccctt tttg          54

<210>8

<211>58

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>8

cccgcgacac tgtaattcct gttcgaacag gaattacagt gtcgcgggaa aaacttaa      58