筛选适合酸中毒小鼠骨骼肌组织蛋白提取的裂解液

摘要

背景:RIPA Buffer对不同组织细胞总蛋白的提取效率有差异,并不通适于所有的组织样本。目的:筛选适合酸中毒小鼠骨骼肌组织蛋白提取的裂解液,为研究骨骼肌萎缩奠定基础。方法:3月龄健康雄性C57BL/6小鼠20只,体质量25-30 g,由山西医科大学实验动物中心提供。麻醉后脱臼处死小鼠,分离获取下肢腓肠肌。实验分为2组:HCl诱导酸中毒组每日定时供给10 g混合10 mL 0.4 mol/L HCl的饲料;对照组饲料中混合同等量的H2O,连续7 d。比较RIPA Buffer、Original Buffer和JP Buffer对酸中毒小鼠骨骼肌组织蛋白的提取效果;蛋白免疫印迹实验检测AKT、p-AKT(Thr308)、rp S6和p-rp S6(Ser235/236)的表达;RT-qPCR定量分析GLUT4的表达。结果与结论:①3种裂解液对骨骼肌组织蛋白的提取能力有差异,JP Buffer提取蛋白产量高,但是目的蛋白信号并不强;RIPA Buffer提取蛋白产量相对偏低;Original Buffer提取足量骨骼肌组织蛋白,蛋白免疫印迹显示目的蛋白条带清晰;②蛋白免疫印迹实验评分显示,Original Buffer总分高于其他2种裂解液;③蛋白免疫印迹实验结果显示,酸中毒组和对照组AKT、rpS6磷酸化程度均无变化;④RT-qPCR定量分析显示,酸中毒组和对照组RNA水平GLUT4表达无变化; ⑤结果提示,OriginalBuffer是提取骨骼肌组织蛋白的最佳裂解液;短期HCl诱导酸中毒组AKT信号通路未激活,延长酸中毒时间是否会激活该信号通路值得研究。针对不同实验样本选择合适的裂解液是保证蛋白免疫印迹实验结果可信度的前提。