红细胞生成素基因修饰内皮祖细胞移植对大鼠糖皮质激素性股骨头坏死的影响

摘要

目的 观察移植红细胞生成素(EPO)修饰的内皮祖细胞(EPC)对大鼠糖皮质激素性股骨头坏死的影响和机制.方法 体外复苏并培养EPC,制备EPC悬液并用羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(CFSE)进行标记.真核表达质粒pcDNA3-EPO转染EPC,转染后2和4周Western印迹法检测EPC中EPO蛋白表达.SD大鼠im给予醋酸泼尼松龙注射液49 mg·kg-1,连续7 d,观察病理变化确定股骨头坏死模型成功.模型大鼠分为模型组(尾静脉注射L-DMEM 0.5 mL)、EPC组(尾静脉注射EPC 6×108 L-10.5 mL)和EPO基因修饰EPC组(EPO-EPC,尾静脉注射EPO-EPC悬液6×108 L-10.5 mL),每天1次,连续7 d.每组分别取5只大鼠的股骨头,RT-PCR和Western印迹法检测股骨头组织中活化胱天蛋白酶3、P53正向细胞凋亡调控因子(Puma)、BCL-XL和EPO基因及蛋白表达水平;TUNEL法观察骨坏死区骨细胞凋亡.4周后进行行为实验检测大鼠的平均速度、总的运动长度、自主活动次数和抓力;HE染色观察股骨头病理变化并进行形态计量学分析;荧光显微镜观察股骨头CFSE标记细胞分布.结果 Western印迹结果显示,EPC在转染人EPO基因2和4周后EPO高表达(P<0.01).RT-PCR和Western印迹结果显示,与模型组相比,EPC组大鼠股骨头坏死区组织活化胱天蛋白酶3和Puma基因及蛋白表达明显降低(P<0.05);BCL-XL和EPO基因和蛋白表达明显升高(P<0.05,P<0.01);与EPC组相比,EPO-EPC组大鼠股骨头坏死区组织活化胱天蛋白酶3和Puma基因及蛋白表达明显降低(P<0.05),BCL-XL和EPO基因及蛋白表达明显升高(P<0.05).TUNEL检测结果显示,与模型组相比,EPC组骨细胞凋亡率降低(P<0.01);与EPC组相比,EPO-EPC组骨细胞凋亡率降低(P<0.01).行为学检测表明,与模型组相比,EPC组相关指标升高(P<0.05);与EPC组相比,EPO-EPC组相关指标升高(P<0.05).HE染色显示,模型组骨小梁形态不规则,明显变窄,变稀疏,骨小梁分割程度亦明显下降;EPC组骨小梁变窄减轻,断裂明显减少,部分骨小梁较粗;EPO-EPC组上述病理变化进一步减轻.骨组织形态计量学测定显示,与模型组相比,EPC组骨小梁面积百分数和骨小梁宽度显著增加(P<0.05),骨小梁分离度显著减少(P<0.05);与EPC组相比,EPO-EPC组骨小梁面积百分数和骨小梁宽度显著增加(P<0.05),骨小梁分离度显著减少(P<0.05).CFSE标记细胞显示,模型组未见标记细胞;EPC组为32±4;EPO-EPC组为54±5,与EPC组相比显著增加(P<0.01).结论 移植EPO-EPC对大鼠糖皮质激素性股骨头坏死具有保护作用.