基于报告基因的胰岛素受体蛋白酪氨酸激酶激动剂细胞筛选模型的建立

摘要

目的 建立用于大规模筛选胰岛素受体蛋白酪氨酸激酶(IRTK)激动剂的细胞模型.方法 将含有编码胰岛素受体(IR)基因、转录激活因子5B(STAT5B)基因和STAT5应答元件调控的荧光素酶基因的质粒瞬时共转染仓鼠卵巢(CHO)细胞, 人肝癌细胞HepG2和小鼠骨骼肌成肌细胞C2C12, 将具有较高的胰岛素诱导表达荧光素酶活性的细胞经 G418 筛选,获得具有胰岛素诱导表达荧光素酶活性的细胞克隆.RT-PCR检测外源基因的表达的稳定性.荧光素酶活性分析和MTT法检测胰岛素处理后荧光素酶诱导表达的量效关系,以及AG1024和AG490处理后胰岛素诱导荧光素酶表达的特异性.并在96孔板上优化荧光素酶的检测条件.结果 共转染的CHO细胞较HepG2 和C2C12表现出更高胰岛素诱导的荧光素酶活性,经G418筛选得到一株具有较高诱导表达率的细胞克隆.RT-PCR表明,该细胞克隆表达外源胰岛素受体和STAT5B.该细胞中荧光素酶的诱导表达对于胰岛素具有剂量依赖性.IRTK抑制剂AG1024能阻断胰岛素诱导荧光素酶的表达,而Jak激酶抑制剂AG490无此作用.在96孔板上的荧光素酶的优化检测条件为:接种量每孔15×103个细胞,受试物诱导表达8 h ,Promega荧光素酶检测试剂按推荐量进行4倍稀释使用.结论 在转基因CHO细胞中,IRTK的激活能灵敏、特异地诱导荧光素酶的表达.因此,该细胞模型可用于IRTK激动剂的高通量筛选.