Diazoxide对缺氧大鼠肺动脉平滑肌细胞内氧自由基的变化及细胞增殖的作用

摘要

目的:研究线粒体膜上ATP敏感钾通道(MitoKATP)开放剂diazoxide和线粒体膜电位(△ψm)在缺氧导致的大鼠肺动脉平滑肌细胞内氧自由基的变化及细胞增殖/凋亡失衡中的作用,探索缺氧性肺动脉重建和肺动脉高压形成的发生机制.方法:取大鼠正常肺组织,分离出肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)进行常氧或慢性缺氧培养.将样本分为6组:①正常对照组;②线粒体膜上ATP敏感钾通道(MitoKATP)开放剂diazoxide组;③MitoKATP阻断剂5-HD组;④慢性缺氧(CH)组;⑤CH+diazoxide组;⑥CH+5-HD组.利用激光共焦显微镜(Leica SP-1 USA)成像检测线粒体膜电位,荧光染色检测细胞内氧自由基含量,流式细胞仪检测细胞周期和MTT法检测细胞增殖情况.结果:①Diazoxide作用24 h后,R-123荧光强度明显强于正常对照组,线粒体膜电位去极化,细胞内氧自由基含量明显高于正常对照组,细胞增殖明显多于正常对照组、凋亡少于正常对照组,P＜0.05;而5-HD作用24 h后,上述指标与正常对照组相比较,均无显著差异,P＞0.05;②慢性缺氧24 h,结果与diazoxide组相似,R-123荧光强度明显强于正常对照组,线粒体膜电位去极化,细胞内氧自由基含量明显高于正常对照组,细胞增殖明显多于正常对照组、凋亡少于正常对照组,P＜0.05;CH+diazoxide组,R-123荧光强度和线粒体膜电位去极化明显强于缺氧组,细胞内氧自由基含量明显高于缺氧组,细胞增殖明显多于缺氧组、凋亡少于缺氧组,P＜0.05;CH+5-HD组,R-123荧光强度和线粒体膜电位去极化明显弱于缺氧组,细胞内氧自由基含量明显低于缺氧组,细胞增殖明显少于缺氧组、凋亡多于缺氧组,P＜0.05;R-123荧光强度、MTT的A值与细胞内氧自由基含量均呈显著正相关;凋亡细胞百分比与细胞内氧自由基含量呈显著负相关.结论:本实验结果显示,diazoxide能够通过开放线粒体膜上ATP敏感的钾通道.引起△ψm去极化,△ψm的变化影响细胞内氧自由基的含量,氧自由基可能作为信号分子通过影响肺动脉平滑肌细胞的增殖/凋亡的平衡,参与了缺氧性肺动脉重建和肺动脉高压的发生和发展过程.