缺氧条件下大鼠肺动脉平滑肌细胞中活性氧对缺氧诱导因子-1α和细胞增殖作用的研究

摘要

目的:1. 观察在缺氧条件下,大鼠肺动脉平滑肌细胞中活性氧（ROS）的变化趋势。
　　 2. 探讨在缺氧条件下，大鼠肺动脉平滑肌细胞中ROS的变化是否调控缺氧诱导因子-1apha（HIF-1α）的表达，进而影响平滑肌细胞的增殖。
　　 材料与方法：本实验采用组织块贴壁法原代培养大鼠肺动脉平滑肌细胞（PASMCs），用胰蛋白酶消化法传代细胞，并将PASMCs随机分成3组：常氧组（21％O2，24小时，A组），缺氧组（5％O2，24小时，B组），缺氧+Mn-TBAP组（5％O2，24小时，C组，Mn-TBAP是一种ROS的清除剂）。用激光共聚焦显微镜荧光染色法检测不同组中细胞的平均荧光强度，从而反映细胞内活性氧的表达水平；用逆转录-聚合酶联反应（RT-PCR）和免疫组织化学链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶连接（SP）法分别测定不同组中HIF-1αmRNA和HIF-1α蛋白的表达水平；用四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法检测不同组的细胞增殖程度。
　　 结果:
　　 1. 缺氧组细胞中活性氧（69.59±3.50）比常氧组（27.39±2.25）明显增加（n=6，P<0.05）；缺氧＋Mn-TBAP组细胞内活性氧（41.09±2.47）低于缺氧组（n=6，P<0.05），但高于常氧组(n=6，P<0.05)。
　　 2.与常氧组（HIF-1αmRNA: 0.16±0.03,蛋白：186.46±5.13）比较，缺氧组HIF-1αmRNA(0.43±0.02)和蛋白（146.93±14.48）的表达明显增强（n=6，P<0.05）；而缺氧＋Mn-TBAP组的HIF-1αmRNA(0.25±0.03)和蛋白（160.07±7.21）均比缺氧组减弱(n=6,P<0.05)，但仍比常氧组升高（n=6，P<0.05）。
　　 3. 缺氧组的平滑肌细胞增殖程度（0.20±0.01）比常氧组（0.12±0.01）显著升高（n=6，P<0.05）；缺氧＋Mn-TBAP组的平滑肌细胞增殖程度（0.16±0.01）比缺氧组有显著的降低（n=6，P<0.05），但高于常氧组（n=6，P<0.05）。
　　 结论: 缺氧条件下，肺动脉平滑肌细胞中ROS含量是增加的；缺氧可以使肺动脉平滑肌细胞中HIF-1αmRNA和蛋白表达均明显升高，同时促进平滑肌细胞的增殖；当减少肺动脉平滑肌细胞中ROS含量时，能抑制上述缺氧对HIF-1α和平滑肌细胞增殖的促进作用。这些说明：1.在肺动脉平滑肌细胞中，ROS可能作为一种信号分子参与缺氧感受信号转导途径；2. 在肺动脉平滑肌细胞中,缺氧对HIF-1α的调节可以发生于转录，翻译和翻译后水平；3. 平滑肌细胞内活性氧、HIF-1αmRNA和蛋白及细胞增殖的变化趋势一致，说明活性氧与HIF-1αmRNA和蛋白表达以及细胞增殖有关。活性氧可能参与某些信号转导通路，或者通过影响特定羟化酶的活性,从而促进HIF-1α表达。同时ROS通过调节HIF-1α的表达，进而影响平滑肌细胞的增殖。因此，ROS可能在肺动脉高压的发病机制和缺氧信号转导中具有重要的作用。