线粒体DNA拷贝数检测方法的建立及在肾脏疾病诊断中的应用

摘要

目的:建立基于实时定量PCR的线粒体DNA(mtDNA)拷贝数的检测方法,并利用所建立的方法初步检测和探讨mtDNA在肾脏疾病诊断中的应用. 方法:设计mtDNA PCR扩增引物,PCR扩增获得mtDNA片段,与T载体质粒连接,构建mtDNA定量标准品.采用SYBR Green-Ⅰ染料法实时定量PCR方法建立mtDNA定量的标准曲线,检验定量方法的重复性与特异性.利用所建立的方法检测局灶节段性肾小球硬化(FSGS)患者血清mtDNA和尿液微囊泡(MV) mtDNA的变化;此外,还对体外嘌呤霉素氨基核苷(PAN)刺激的足细胞所分泌的MV中mtDNA进行了检测. 结果:(1)选取mtDNA特异性引物,通过SYBRGreen-Ⅰ实时定量PCR建立mtDNA拷贝数绝对定量的检测方法具有良好的特异度、灵敏度和重复性;(2)检测10例FSGS患者和6例正常对照血清mtDNA水平发现,FSGS患者血清mtDNA水平明显低于正常对照(P＜0.05);(3)检测5例FSGS患者与5例健康对照一定体积尿液中MV mtDNA含量发现,FSGS患者高于健康对照,但FSGS患者尿液MV的含量也显著高于健康对照;(4)受PAN刺激的足细胞,其分泌的MV中mtDNA含量下降,与足细胞内mtDNA含量变化相一致. 结论:本方法为探索mtDNA作为肾脏疾病诊断的生物标志物的可能性提供了有效的实验手段.