突变的大肠癌线粒体DNA转染NIH3T3及LST细胞的研究

摘要

目的了解大肠癌细胞株（SW480，LOVO，HT29）线粒体DNA的突变，克隆突变的大肠癌线粒体DNA（mtDNA）基因，构建peDNA3．1（＋）-mtDNA真核表达重组体，并导入NIH3T3及LST细胞，以探讨线粒体基因突变与肿瘤发生的关系。方法提取大肠癌细胞株（SW480，LOVO，HT29）mtDNA，扩增D—LOOP区，产物用DNA自动测序法进行序列分析。利用DNA重组技术将其定向插入真核表达质粒peDNA3．1（＋），并用脂质体法导人NIH3T3及LST细胞。用MitoCa．ptureMitochondrialApoptosisDetectionKit试剂盒染色后用流式细胞仪及荧光显微镜检测转染细胞的凋亡情况。扩增并测序分析转染细胞的D—LOOP区突变特点。结果检测出大肠癌细胞株SW480，LOVO，HT29细胞mtDNAD—LOOP分别有10，9，8个突变位点。转染前后，各组间细胞凋亡无明显变化。转染细胞的核基因组可扩增出目的基因及Neo基因。4株NIH3T3转染细胞mtDNAD-环区分别检测到9，11，8，4个突变点，并相应有3，4，3，2个多态性变化。结论（1）转染突变的大肠癌细胞mtDNA后转染细胞的mtDNA均可发生多处的突变位点。（2）通过转染后突变的外源性的mtDNA可以整合到核基因组内。（3）突变的mtDNA转染LST细胞及NIH3T3细胞后，不影响转染细胞的凋亡改变。（4）mtDNA的突变可能通过影响体细胞mtDNA的突变和通过外源性mtDNA在核内的整合从而影响癌基因或抑癌基因的表达异常，从而参与肿瘤的发生发展。