突变的大肠癌线粒体DNA转染NIH3T3及LST细胞的研究

摘要

目的 了解大肠癌细胞株(SW480,LOVO,HT29)线粒体DNA的突变,克隆突变的大肠癌线粒体DNA(mtDNA)基因,构建pcDNA3.1(+)-mtDNA真核表达重组体,并导人NIH3T3及LST细胞,以探讨线粒体基因突变与肿瘤发生的关系.方法 提取大肠癌细胞株(SW480,LOVO,HT29)mtDNA,扩增D-LOOP区,产物用DNA自动测序法进行序列分析.利用DNA重组技术将其定向插人真核表达质粒pcDNA3.1(+),并用脂质体法导人NIH3T3及LST细胞.用MitoCapture Mitochondrial Apoptosis Detection Kit试剂盒染色后用流式细胞仪及荧光显微镜检测转染细胞的凋亡情况.扩增并测序分析转染细胞的D-LOOP区突变特点.结果 检测出大肠癌细胞株SW480、LOVO和HT29细胞mtDNA D-LOOP分别有10、9和8个突变位点.转染前后,各组间细胞凋亡无明显变化.转染细胞的核基因组可扩增出目的 基因及Neo基因.4株NIH3T3转染细胞mtDNA D-环区分别检测到9、11、8和4个突变点,并相应有3、4、3和2个多态性变化.结论 转染突变的大肠癌细胞mtDNA后转染细胞的mtDNA均可发生多处的突变位点;通过转染后突变的外源性的mtDNA可以整合到核基因组内;突变的mtDNA转染LST细胞及NIH3T3细胞后,不影响转染细胞的凋亡改变;mtDNA的突变可能通过影响体细胞mtDNA的突变和通过外源性mtDNA在核内的整合从而影响癌基因或抑癌基因的表达异常,从而参与肿瘤的发生发展.