多形性腺瘤基因1高表达转基因小鼠动物模型的建立

摘要

目的克隆人多形性腺瘤基因1(pleomorphic adenoma gene 1, PLAG1)基因,构建PLAG1组织非特异性和特异性表达载体,并建立PLAG1转基因小鼠模型,阐明PLAG1基因的高表达与唾液腺肿瘤发生的关系.方法取PLAG1高表达的瘤组织或正常胎盘组织,提取总RNA,逆转录聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)扩增获得PLAG1 cDNA全部编码框序列.将PLAG1分别克隆至pCMV-EGFP和pMMTV-EGFR-stop载体获得pCMV- EGFP/PLAG1和pMMTV-PLAG1表达载体.用pCMV- EGFP/PLAG1瞬时转染NIH3T3细胞以观察融合基因的表达及PLAG1的细胞内定位.经显微注射分别获得pCMV- EGFP/PLAG1和pMMTV-PLAG1转基因小鼠.结果从不同组织来源的RNA克隆的PLAG1 cDNA,经测序后发现与GenBank中的PLAG1基因(GenBank No. U65002)比较有一个碱基差,相应氨基酸由苏氨酸变为脯氨酸.构建的组织非特异性表达载体pCMV-EGFP/PLAG1和组织特异性表达载体pMMTV-PLAG1经酶切和测序鉴定,证实PLAG1序列及插入方向正确.用pCMV-EGFP/PLAG1转染NIH3T3细胞,在细胞水平证明PLAG1的表达及其在细胞核的定位.两种表达载体分别经显微注射,获得了多个转基因阳性小鼠(Founders, G0代),经交配繁育,建立了相应的转基因小鼠系.转基因的表达分别经RT-PCR和Northern杂交证实.表型观察发现pMMTV-PLAG1转基因小鼠系M42在出生后3个月内,100%的阳性小鼠发生唾液腺肿瘤.结论从多个肿瘤标本及正常胎盘组织克隆的PLAG1基因在同一位置与GenBank中的相应序列相比,发现相同的核苷酸变异,说明这种核苷酸的变异并非由肿瘤组织内的基因突变或PCR错配所致.该位点可能是一个单核苷酸多态性位点,有待进一步证实.PLAG1在细胞内定位于细胞核,符合转录因子的细胞核分布规律.Plag1转基因小鼠的表型提示该基因的高表达与唾液腺肿瘤的发生密切相关.