肌醇酶1信号通路对氟诱导的成骨细胞分化的影响

摘要

目的观察染氟成骨细胞未折叠蛋白反应肌醇酶1（IRE1）-Xbp1信号通路的表达及siRNA干扰抑制IRE1表达后成骨细胞内成骨细胞标志物的变化趋势。方法细胞增殖毒性（CCK-8）实验检测成骨细胞MC3T3-E1增殖活性，设置0．0、0．1、1．0、2．0、4．0、8．0、16．0、20．0、32．0、64．0mg／L10个不同氟含量组；选取具有代表性的低、中、高剂量氟（含量分别为2．0、8．0、20．0mg／L）作用于MC3T3-E1细胞2d，采用实时荧光定量PCR（Real-timePCR）检测MC3T3-E1细胞中未折叠蛋白反应相关基因和成骨细胞标志物[碱性磷酸酶（ALP）、骨钙素（OCN）、Runx2、osterix、免疫球蛋白重链结合蛋白（Bip）、蛋白激酶R样内质网激酶（PERK）、活化转录因子6（ATE6）、Xbp1]的表达：IRE1siRNA转染MC3T3-E1细胞并联合染氟，Real-timePCR和蛋白免疫印迹法检测MC3T3-E1细胞中IRE1信号通路和成骨细胞标志物的表达。结果CCK-8检测结果显示氟的双向效应，即与0．0mg／L组[1．00±0．01（1d）、1．00±0．02（3d）、1．00±0．08（7d）]比较，成骨细胞活性在2．0mg／L染氟组[1．11±0．02（1d）、1．29±0．02（3d）]、8．0mg／L染氟组[1．16±0．02（1d）、1．44±0．03（3d）]显著增强（P均〈0．05），而2（1．0mg／L染氟组却抑制细胞活性[0．83±0．01（1d）、0．81±0．01（3d）、0．96±0．04（7d），P均〈0．05]。2．0mg／L染氟组显著诱导MC3T3-E1细胞内ALP（12．80±3．62）、Runx2（6．61±0．48）和osterix（21．42±1．56）的表达，与0．0mg／L组（6．86±2．13、2．65±0．38、12．48±3．96）比较，差异有统计学意义（P均〈0．05），而20．0mg／L染氟组抑制ALP（0．88±0．17）、OCN（0．16±0．05）和osterix（1．35±0．51）的表达，与0．0mg／L组[4．58±1．52（OCN）]比较，差异均有统计学意义（P均〈0．05）。与0．0mg／L组[1．36±0．58（IRE1）、0．96±0．45（Xbp1）]比较，IRE1[14．84±2．57（2．0mg／L）、4．10±0．52（8．0mg／L）、5．30±0．63（20．0mg／L）]和Xbp1[2．62±0．66（2．0mg／L）、1．97±0．47（20．0mg／L）]基因表达在染氟组中均显著升高（P均〈0．05）。IRE1基因敲除后，与对照组比较[基因：3．25±0．48（OCN）、5．62±1．86（Runx2）、2．67±0．35（ALP）；蛋白：0．16±0．03（OCN）、0．34±0．27（ALP）]，OCN基因表达[0．63±0．46（2．0mg／L）、0．81±0．36（8．0mg／L）、0．62±0．31（20．0mg／L）]、Runx2基因表达[0．18±0．03（2．0mg／L）、0．12±0．01（8．0mg／L）、1．09±0．33（20．0mg／L）]和ALP基因表达[1．01±0．12（8．0mg／L）、0．38±0．09（20．0mg／L）]在染氟组均显著下降（P均〈0．05），OCN蛋白表达[0．06±0．02（2．0mg／L）、0．06±0．02（8．0mg／L）、0．07±0．03（20．0mg／L）]、ALP蛋白表达[0．02±0．01（8．0mg／L）、0（20．0mg／L）]在染氟组均显著下降（P均〈0．05）。结论不同剂量的氟作用下成骨细胞内均出现未折叠蛋白反应，IRE1基因敲除能够抑制低氟诱导的成骨细胞内ALP、OCN和关键转录因子Runx2、osterix的表达，提示IRE1信号通路在氟诱导的成骨细胞的分化过程中有-定作用。