烟曲霉硫氧还蛋白还原酶双抗体夹心ELISA法的建立及初步应用

摘要

目的 建立检测烟曲霉硫氧还蛋白还原酶GliT(thioredoxin reductase GliT,TR)的双抗体夹心ELISA法,并用于几种真菌培养上清液中TR蛋白的检测.方法 纯化鼠抗人TR单克隆抗体并进行辣根过氧化物酶(HRP)标记.以纯化羊抗TR多克隆抗体为包被抗体,HRP标记鼠抗人TR单克隆抗体为检测抗体,建立双抗体夹心ELISA法.用方阵滴定法确定包被抗体和检测抗体的最适浓度;对方法的精密度、特异性和最低检测限进行评价;比较分析其检测3种常见曲霉(烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉)培养上清中天然TR蛋白的能力,并与3种常见假丝酵母菌(白假丝酵母菌、热带假丝酵母菌、光滑假丝酵母菌)作比较.结果 方阵滴定的结果显示最适包被抗体浓度为1 μg/mL,最适检测抗体的稀释度为1:3 000.抗原最低检测限达2.25ng/mL.重组TR浓度为5 ng/mL和20 ng/mL时,批内和批间变异系数分别为8.57％、12.69％和6.73％、10.45％.阻断实验显示该法有较好的特异性,阻断率达84.7％.该法可以检出烟曲霉24 h培养上清中的天然TR,TR含量与烟曲霉菌丝含量呈正相关.本法与另2种曲霉和3种假丝酵母菌培养上清无交叉反应.结论 成功建立并优化了检测烟曲霉TR抗原的ELISA法.该法具有良好的精密度及特异性,对烟曲霉感染有潜在的诊断价值.