蚯蚓纤溶酶基因(Efp-Ⅰ)在大肠杆菌中的克隆、表达及活性分析

摘要

从GenBank查询到的蚯蚓纤溶酶earthworm fibrinolytic enzyme,EFE)基因序列中,只有AY438624翻译的蛋白质序列与天然EfP-Ⅰ在N-端具有较高的相似性.根据该基因的5'与3'序列设计引物,通过RT-PCR从赤子爱胜蚓(Eisenia fetida)获得一个完整的基因(GenBank,DQ418454).序列分析证明,由该基因编码蛋白质的N-末端与天然EfP-Ⅰ的N-末端的氨基酸顺序完全相同.SeanPmsite prediction programs分析显示,该基因与AY438624相似性极高,二者均属于胰蛋白酶家族;不同的是,该基因编码蛋白质的序列中含有N-糖苷键的结构域,所以DQ418454是Efp-Ⅰ中的一个新基因.在此基础上,构建了该基因的原核表达裁体pMAL-c2X-Efp-Ⅰ,并进行了转化、诱导和表达.Western blotting证明,表达产物同时具有MBP和Efp-Ⅰ的抗原特异性,是MBP和Efp-Ⅰ的融合蛋白(MBP-EfP-Ⅰ).经亲和层析分离纯化的MBP-EfP-Ⅰ,在酪蛋白平板和纤维蛋白平板上表现出明显的纤溶酶活性.