牛凝乳酶原基因的合成及其在乳酸克鲁维酵母中的表达

摘要

凝乳酶在奶酪加工中应用广泛,为获得高活性的凝乳酶制剂,采用乳酸克鲁维酵母为宿主,首次对经密码子优化的牛凝乳酶原基因进行表达.利用DNAWorks3.0 软件辅助设计,用两步PCR 法合成了小牛凝乳酶原基因(GenBank Accession No. AA30448).将该基因插入酵母表达载体pKLAC1,构建了重组载体pKLAC1-Prochy,并用电脉冲法将线性化的重组质粒转化到乳酸克鲁维酵母GG799 中.通过含1%酪蛋白的YEPD 平板活性筛选,PCR 鉴定,最后获得了一株多拷贝整合的基因工程菌chy1.该菌株可分泌表达牛凝乳酶原,经SDS-PAGE 分析,证明重组牛凝乳酶原的分子量约为41 kDa,符合预期大小,酸化处理后为36 kDa,证明可以正确自我剪切.液体培养96 h 后,酶活最高达到99.67 SU/mL.分别以半乳糖和葡萄糖为碳源的条件下表达,其酶活性差异不大,说明在发酵期间,可以不经过半乳糖诱导即可产生高水平的牛凝乳酶原产物.该工程菌的获得为进一步优化产酶条件及放大工艺提供了条件,并为凝乳酶的工业化生产奠定了基础.