结核分枝杆菌CFP10、 ESAT6、 Ag85A和Ag85B抗原真核共表达载体的构建与表达

摘要

CFP10、ESAT6、Ag85A和Ag85B是结核分枝杆菌的主要免疫优势抗原.为了构建一种可同时表达这4种抗原的真核多基因共表达载体pcDNA-CFP 10-ESAT6-Ag85A-Ag85B (pcDNA-CEAB),并利用HEK 293T细胞对其体外表达进行检测.采用酶切、连接的方法,将CFP10和ESAT6编码基因以(Gly4Ser)3蛋白Linker连接,插入至质粒pcDNA3.1(+)多克隆位点CMV启动子与加尾信号BGH pA之间,使两者融合表达,将Ag85A和Ag85B编码基因以内部核糖体进入位点(Internal ribosome entry site,IRES)序列连接,并赋予RSV启动子和加尾信号BGH pA,使两者在RSV启动子作用下独立表达.重组质粒经酶切及测序验证后转染至HEK 293T细胞中进行体外表达实验,48 h后提取总蛋白,利用CFP10、ESAT6、Ag85A和Ag85B特异性抗体进行Westernblotting检测.结果显示多基因共表达载体pcDNA-CEAB在真核细胞HEK 293T中得到表达,且CFP 10、ESAT6、Ag85A和Ag85B抗原能被相应的特异性抗体所识别,表明质粒pcDNA-CEAB构建正确,这为进一步研究其免疫原性和免疫保护效果奠定了基础.