人脑源性神经营养因子重组腺病毒载体的构建、鉴定及其在HEK293A细胞中的表达

摘要

目的 构建人脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)重组腺病毒真核表达载体,研究其在无BDNF分泌的HEK293A细胞中的表达情况,为临床上治疗创伤性脑损伤提供更多基础方面的研究资料.方法 ①以供体质粒和pAdEasy-1腺病毒系统作为底物构建人BDNF重组腺病毒真核表达载体并包装病毒,检测滴度；②将含人BDNF基因的腺病毒液(A组,实验组)及未含任何基因片段的空白病毒液(B组,对照组)分别转染HEK293A细胞,同时设立空白组(C组),72 h后通过倒置荧光显微镜观察转染情况；③采用RT-PCR方法检测转染后各组细胞中BDNF基因mRNA表达情况；④采用Western blotting方法检测转染后各组细胞BDNF蛋白表达情况.结果 ①成功构建人BDNF重组腺病毒真核表达载体,经过包装后病毒滴度为1.74×108 pfu/mL；②B、C两组细胞BDNF的mRNA表达差异无统计学意义(P＞0.05),而A组细胞BDNF的mRNA表达量明显高于B、C两组,差异有统计学意义(P＜0.05)；③B、C两组细胞BDNF的蛋白表达差异无统计学意义(P＞0.05),A组蛋白表达相对OD值明显高于另外两组,差异有统计学意义P＜0.05).结论 人BDNF重组腺病毒载体的成功构建不仅明显提高了BDNF基因在细胞中的表达水平,同时还为其进一步应用于创伤性脑损伤的体内实验研究打下基础.