人FcγRⅡb1基因真核载体的构建、表达及其对B细胞增殖的影响

摘要

目的 构建人FcγRⅡb1基因的真核表达载体并转染人B细胞,观察其在B细胞的表达及其对细胞增殖的影响.方法 分离健康人外周血B细胞,提取总RNA并逆转录为cDNA,采用PCR技术扩增出含有EcoR Ⅰ和SalⅠ酶切位点的人FcγRⅡb1基因片段,将双酶切产物通过T4 DNA连接酶定向插入pIRES2-EGFP真核载体相应位点中,经酶切及双向测序鉴定其序列的正确性.通过电穿孔法将pIRES2-EGFP-Fc γ RⅡb1重组载体转入人B细胞中,采用荧光显微镜及流式细胞术检测转染效率及细胞表面FcγRⅡb1分子的表达水平,采用3H-TdR掺入法检测转染FcγRⅡb1基因对B细胞增殖能力的影响.结果 酶切及测序鉴定pIRES2-EGFP-FcγRⅡb1重组质粒基因序列完全正确,重组质粒转染细胞的效率为15.5％,转染细胞表面FcγRⅡb1分子的表达水平显著增高,并显著抑制了B细胞增殖能力.结论 成功构建了pIRES2-EGFP-FcγRⅡb1真核表达载体,并赋予了FcγRⅡb1分子发挥免疫抑制功能的作用.