构建shRNA真核表达载体沉默NOTCH1基因对乳腺癌MCF-7细胞增殖的影响

摘要

目的:通过构建靶向Notch1基因的shRNA真核表达载体，探讨小干扰RNA干扰技术沉默Notch1基因表达对人乳腺癌MCF-7细胞生物学的影响。
　　 方法:根据Genebank提供NOTCH1基因序列，遵循siRNA设计原则，设计2条干扰序列，退火后分别克隆到含BamHⅠ及HindⅢ双酶切位点的pGsensil表达载体中，并进行双酶切、测序鉴定。用脂质体介导法将2个shRNA真表达载体分别转染到乳腺癌MCF-7细胞中。采用RT-PCR方法检测转染前后乳腺癌细胞中NOTCH1基因mRNA表达的变化，筛选出干扰效率最强的shRNA。将筛选出的干扰效率最强的shRNA稳定转染到MCF-7细胞。运用RT-PCR、Western Blotting及MTT分别检测干扰阻断Notch1信号通路前后MCF-7细胞的RNA、蛋白质及细胞增殖的变化。
　　 结果:重组质粒经BamHⅠ及HindⅢ双酶切后形成条带与预计值一致，插入序列经基因测序与设计序列相符。与正常对照组相比转染pGenesil-NOTCH1-shRNA1、转染pGenesil-NOTCH1-shRNA2的MCF-7细胞中NOTCH1基因mRNA的表达明显降低(p＜0.05)。其中pGenesil-NOTCH1-shRNA2的干扰效果最强。将干扰效率最强的pGenesil-NOTCH1-shRNA2重组质粒稳定转染MCF-7细胞后，采用RT-PCR及Western Blotting检测Notch1基因的mRNA及蛋白表达均下调(p＜0.05)。METT检测细胞增殖状况，与对照组相比细胞增殖率降低（p＜0.05）。
　　 结论：成功构建了NOTCH1基因的shRNA真核表达载体pGenesil-NOTCH1-shRNA并且有效的抑制了乳腺癌细胞中NOTCH1基因mRNA、蛋白表达和MCF-7细胞的增殖。

目录

摘要

引言

第一章 NOTCH1基因的真核表达载体shRNA的构建及鉴定

1．1 材料

1．2 shRNA重组质粒的构建

1．2．1 退火

1．2．2 连接

1．2．3 转化大肠杆菌

1．2．4 摇菌

1．3 shRNA重组质粒的鉴定

1．3．1 质粒提取

1．3．2 酶切、电泳检测

1．3．3 细胞的传代和培养

1．3．4 稳定转染pGenesil-NOTCH1-shRNA

1．3．5 Trizol法提取细胞总RNA

1．3．6 逆转录

1．3．7 qRT-PCR

第二章 shRNA沉默NOTCH1基因对MCF-7细胞增殖的影响

2．1 材料

2．2 细胞复苏

2．3 细胞的传代和培养

2．4 细胞收集

2．5 Western blot

2．5．1 总蛋白提取

2．5．2 BCA法检测蛋白浓度

2．5．3 Western bloting实验

2．6 MTT

2．7 统计学方法

第三章 结果

3．1 重组真核表达载体检测

3．1．1 酶切检测

3．1．2 序列检测

3．2 qRT-PCR检测Notch1 mRNA的表达

3．3 Western blotting检测Notch1蛋白的表达

3．4 MTT检测

讨论

结论

参考文献

综述

攻读学位期间的研究成果

致谢

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