Survivin基因及CDK1基因联合靶向shRNA真核表达载体的构建

摘要

目的:shRNA干扰技术可以使细胞出现靶基因沉默,具有高特异性、高效性、低毒性等特点现已广泛应用于生物医学研究的各个领域,为快速下调靶基因表达的有效手段之一.shRNA干扰技术有望成为治疗肿瘤治疗的新手段,但仍需解决诸多问题以提高疗效,其中就有通过多个基因的联合干扰的方法.本研究采用一个pU6-M4载体携带两个shRNA目的基因,构建靶向Survivin基因及CDK1基因的短发夹样RNA(short hairpin RNA,shRNA)真核表达载体,为进一步研究Survivin基因和CDK1基因联合干扰提供科学依据.方法:根据Genbank报道的Survivin序列及CDK1序列,遵循shRNA设计原则设计并合成各自靶向的Survivin、CDK1基因的shRNA寡核苷酸序列,构建pU6-shRNA-Survivin重组质粒、pU6-shRNA-CDK1重组质粒及pU6-shRNA-Survivin-U6-shRNA-CDK1双基因序列串联重组质粒,并进行限制性内切酶酶切及测序鉴定.结果:经酶切及测序结果分析,pU6-shRNA-Survivin重组质粒、pU6-shRNA-CDK1重组质粒及pU6-shRNA-Survivin-U6-shRNA-CDK1双基因系列串联重组质粒均成功构建.根据质粒的结构及多克隆位点分析,串联重组的质粒经EcoRI和HindⅢ酶切鉴定,可以切出U6-shRNA-survivin-U6-shRNA-CDK1片段约800bp及4.5kb的大片段. 用HindⅢ和XhoI酶切鉴定,可以切出U6-shRNA-survivin、U6-shRNA-CDK1片段各约400bp,经酶切鉴定分析,pU6-shRNA-Survivin-U6-shRNA-CDK1符合酶切设计要求,测序结果显示插入的双基因序列正确.结论:shRNA干扰技术是将与靶mRNA配对的含有发夹状结构的RNA序列通过载体转入细胞,利用U6启动子确保shRNA表达并能传给子代细胞,shRNA在胞浆内被Dicer酶裂解成约21～25个碱基对的两端有少数未配对突出碱基的干扰RNA(siRNAs),这些siRNAs解链成单链并整合到活化的RNA诱导沉默复合物(RICS)上,整合后的siRNA碱基与靶mRNA配对,干扰靶mRNA,从而阻止其作为模板进行翻译,使细胞出现靶基因沉默现象,即出现RNA干扰效应(RNAi).本研究采用一个pU6-M4质粒载体携带2个shRNA的干扰技术,成功构建survivin和CDK1基因联合靶向的shRNA重组表达载体,为进一步探讨同时下调肿瘤细胞中的survivin和CDK1基因的表达是否具有协同增强干扰效应提供了条件,也为肿瘤靶向基因治疗的可行性提供新的思路。