小鼠 LIGHT 胞外段基因原核表达载体的构建及其多克隆抗体的制备

摘要

目的：PCR 扩增小鼠 LIGHT 胞外段基因（LIGHTECD），构建含 LIGHTECD的原核表达载体，诱导表达重组蛋白，并免疫新西兰兔，制备多克隆抗体。方法：提取小鼠骨髓来源的未成熟树突状细胞中的总 mRNA，RT-PCR 技术扩增 LIGHTECD，克隆至原核表达质粒 pGEX-6P-2中，构建重组表达载体pGEX-6P-2-LIGHTECD。重组质粒进行 PCR 和基因测序鉴定后，转化大肠杆菌 XL-1 Blue，IPTG 诱导表达。融合蛋白纯化后纯化后免疫新西兰兔，ELISA 及Western- blot 分析兔血清中抗 LIGHTECD抗体的效价和特异性。结果：RT-PCR 扩增得到525 bp LIGHTECD目的片段；经 PCR 和测序鉴定，证明构建的重组质粒中插入的片段为 LIGHTECD基因，测序结果经 BLAST 分析，与 Genbank 上登录序列完全一致；经 IPTG 诱导，重组质粒表达一相对分子量（Mr）约为45kD 的目的蛋白条带。ELISA 检测免疫兔血清效价为1∶20000。结论：成功地克隆了小鼠 LIGHT 胞外段基因，并表达了相应可溶性蛋白，准备了高效价的兔抗 LIGHTECD多克隆抗体，为进一步研究其功能奠定了基础。