小鼠、大鼠、猪DHRS4基因原核表达载体的构建、表达及小鼠DHRS4多克隆抗体的制备

摘要

目的:辅酶Ⅱ依赖性视黄醇脱氢/还原酶(NADP(H)-dependent retinol dehydrogenase/reductase,NRDR)是全反式维甲酸(all-trans retinoic acid,atRA)代谢生成途径中的一种关键酶。atRA在体内是由维生素A(Vitamin A)即视黄醇(Retinol)经过两步代谢生成,中间的代谢产物为视黄醛(Retinal),辅酶Ⅱ依赖性视黄醇脱氢/还原酶在从Retinol到Retinal这一步中起着关键作用。
　　NRDR基因位于人的14q11.2,包含三个拷贝,分别命名为DHRS4、DHRS4L2和DHRS4L1,但在其他哺乳动物体内多只存在DHRS4一个单拷贝,如大鼠、小鼠、猪、牛、马、狗等。在另外一些动物中只存在有两个拷贝,其分别为DHRS4和DHRS4L1,如黑猩猩、类人猿。对于人体内NRDR的研究发现其存在比较复杂的调控表达方式,通过小鼠这样的只有DHRS4一个单拷贝的动物作为一个模型进行研究能帮助我们进一步探寻人体内NRDR调控表达,因此,DHRS4原核表达载体的构建及小鼠多克隆抗体为本课题组以小鼠作为模型进行研究提供了帮助。
　　对于辅酶Ⅱ依赖性视黄醇脱氢/还原酶在生物体内所发挥的作用及其酶活性,本课题组已对兔子体内该酶所发挥的作用做了深入的研究,发现这种酶不仅具有很高的催化视黄醇、视黄醛之间氧化还原的活性,而且对其他类似视黄醇、视黄醛的醛酮类物质存在氧化还原活性。对于其他动物体内该酶的活性,近年来有文章发现各种动物体内该酶的作用存在差异,特别是在人体内该酶的作用,目前尚少有报道。因此,有必要深入研究其所起的生理功能及其差异。但是,该酶在体内含量低,分离纯化困难。通过体外表达可以得到大量重组酶,从而为DHRS4基因表达调控及功能研究提供实验原料。
　　方法:应用RT-PCR从大鼠、小鼠、猪肝组织扩增DHRS4的开放阅读框序列,测序确认后将其编码区构建到载体pDONRTM201上,再通过LR反应再将其置换到表达载体pDESTTM17上,测序确认后转化到E.coli BL21-AI工程菌中,并经阿拉伯糖诱导表达出DHRS4融合蛋白。以小鼠融合蛋白作为免疫原免疫大白兔,制备小鼠DHRS4多克隆抗体。
　　结果:成功构建大鼠、小鼠、猪DHRS4重组质粒;转化重组质粒的E.coli BL21-AI经阿拉伯糖诱导4h后高效表达DHRS4融合蛋白;Western bolt实验结果显示制备的多克隆抗体可特异性检测小鼠肝组织DHRS4蛋白的表达。
　　结论:成功构建大鼠、小鼠、猪pDESTTM17/DHRS4原核表达载体和获得小鼠抗DHRS4多克隆抗体。

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第一章 前言

1.1 背景

1.2 本项研究课题的研究意义

1.3 研究目标与研究内容

第二章 大鼠、小鼠、猪DHRS4编码区cDNA克隆

2.1 实验材料

2．2 实验方法

3.1 实验材料

3．2 实验方法

3．3 实验结果

第四章 小鼠DHRS4多克隆抗体的制备

4.1 实验材料

4．2 实验方法

4．3 实验结果

第五章 讨论

5.1 讨论

5.2 结论

参考文献

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