重组水蛭素的原核表达及分离纯化

摘要

为了提高水蛭素的生产效率以适应生物医药应用的需求,试验通过对水蛭素基因进行密码子优化,构建了重组水蛭素原核表达系统,并对D600nm值、诱导时间、诱导剂IPTG浓度和诱导温度4种诱导条件进行了探索,同时通过引入试验设计(design of experiment,DOE)方案将4种因素对诱导效率的影响进行进一步系统的优化,使用His Trap亲和层析对重组蛋白进行纯化,并通过凝血酶滴定法对重组水蛭素的活性进行测定.结果显示,试验成功构建重组水蛭素原核表达载体,水蛭素蛋白为可溶性表达.单因素变量优化后的诱导条件为:在菌体密度D600nm值为0.4时,加入1 mmol/L IPTG,37℃下诱导7h,重组水蛭素蛋白表达效率最高,占菌体总蛋白66.5％;而DOE试验优化结果为:在菌体密度D600nm值为0.6时,加入0.82 mmol/L IPTG,31.9℃下诱导7.6h,预测重组水蛭素蛋白表达效率最高,占菌体总蛋白72.7％,显著高于单因子变量法优化结果(P＜0.05).进一步分析发现,各影响因素之间存在明显的交互效应,影响了单因素试验结果的准确性.通过亲和层析纯化后的重组水蛭素纯度可达99％,抗凝活性为114 ATU/mg.研究成功构建了重组水蛭素原核表达载体,对其表达条件进行了优化,并获得了重组水蛭素蛋白,为水蛭素应用于生物医药奠定了基础.