卵母细胞扫描电镜和透射电镜样本的制作

摘要

[目的]探讨卵母细胞扫描电镜和透射电镜的制作方法,为相关研究提供技术支持.[方法]以猪GV期和体外成熟MII期卵母细胞(抽吸法采集)为研究对象.①扫描电镜样本制备:供试GV期和MII期卵母细胞于PBS(pH值7.4)中清洗后,部分转入0.1%透明质酸酶中,38.5 ℃孵育15 min,微吸管吹打去除卵丘细胞(CC),即获得无卵丘细胞的卵母细胞,用以观察卵母细胞外透明带(ZP)结构;取去除卵丘细胞的部分卵母细胞,经PBS液洗后,再置于0.5%链霉蛋白酶中,在实体显微镜下观察,待透明带溶解时,小心地将卵母细胞转入PBS中,即获得了无透明带的卵母细胞,用以观察卵母细胞膜表面的微绒毛(Mv).未去除卵丘细胞的卵母细胞、去除卵丘细胞的卵母细胞及去除透明带的卵母细胞分别经PBS洗2～4次后,于2.5%戊二醛中4 ℃固定6 h,再经PBS清洗3次,每次30 min;再于1%锇酸中固定1.5 h,然后再经PBS清洗3次,每次30 min;之后,用乙醇逐级(30%、50%、70%、90%、100%、100%)脱水,每级20 min;样品脱水后,用乙酸异戊脂置换;置换后的样品直接移到样品台上,再放入临界点干燥仪干燥,粘台,IB-5离子溅射仪喷金,置于扫描电子显微镜下观察、拍照.②透射电镜样本制备:供试卵母细胞也经PBS清洗,戊二醛固定,琼脂包埋后锇酸固定,乙醇脱水,步骤基本同上,只是最后用环氧丙烷置换.脱水后的样品于Epon-812树脂和丙酮等体积混合液中渗透4 h,再在纯Epon-812中渗透过夜;然后将样品包埋,放入聚合器中聚合(35 ℃,24 h;45 ℃,24 h;60 ℃,48 h);聚合后的样品在实体显微镜下修块,半薄切片定位,重新包埋,LKB-V超薄切片机切片;超薄切片用醋酸双氧铀-柠檬酸铅双重染色,样品自然干燥后在透射电子显微镜下观察、拍照.[结果]电镜下观察到的细胞形态结构完好,超微结构清晰.扫描电镜下,GV期卵母细胞的卵丘细胞紧密包围在卵母细胞外,微绒毛呈致密状垂直于卵膜表面,透明带呈不规则的蜂窝状,有小梁突起.在体外成熟MII期卵母细胞中,卵丘细胞变得松散,卵母细胞表面的微绒毛结构显得更光滑,透明带呈不规则的蜂窝样,但蜂窝状结构增多,且小梁突起更明显.透射电镜下,GV期卵母细胞的卵丘细胞在透明带周围紧密排布,并有大量突起伸入透明带中;卵母细胞微绒毛数量较多、相对较长,且也伸入透明带中;线粒体呈圆形,多为横嵴并清晰,成簇分布于皮质区;脂滴以两种不同形式存在于大部分细胞质内,一种呈均质状,另一种不均质且有透亮条纹,两种形式的脂滴常相邻存在,并以均质脂滴居多.脂滴外包有不连续的滑面内质网;高尔基体发达,由多层扁平囊泡及大小泡组成;在MII期卵母细胞中,卵丘细胞间缝隙连接增大,出现了明显的卵周隙;与培养前卵母细胞相比,微绒毛相对较短、较粗,且从ZP内撤回;线粒体体积增大,仍成簇伴随着脂滴分布;脂滴仍以两种不同形式存在,但以不均质脂滴居多;不均质脂滴呈球状,且上透亮条纹增多,电子密度更高;皮质颗粒位于卵质膜下,呈单层排列.[结论]证实该方法适用于卵母细胞超微结构观察的制样,另外,此法也适用于休积小、数量少、游离细胞的电镜样本制备.%[Objective] The research aimed to explore the manufacturing methods of scanning electron microscope (SEM) and transmission electron microscopy (TEM) for oocyte and provide technical support for related research. [Method] Based on GV-and MII-stage oocytes, samples of SEM and TEM were prepared respectively, then ultrastructure changes were observed. [Result]The results showed that the method needed few samples, keep intact cell morphology and can see clear ultrastructure. [Conclusion] The method is suitable for ultrastructural observation of oocyte.