猪α干扰素基因的克隆、原核表达及生物学活性鉴定

摘要

目的 构建稳定、高效表达的重组猪α干扰紊(rpoIFN-α)大肠杆菌表达菌株,并纯化鉴定该菌株表达的目的 蛋白,进行生物学活性检测.方法 提取猪肝脏细胞基因组DNA,PCR扩增猪α干扰素(poIFN-α)基因,克隆到pMD18-T载体上,测序鉴定后再亚克隆到pGEX-5X-1载体上,转化入E.coli BL21中后得到表达菌株,用IPTG诱导表达,收集的菌体超声破碎后取上清得粗制蛋白,用GST亲和层析法进行纯化,产物用Western blot进行鉴定,并在Hep-2/VSV系统上滴定效价.结果 重组质粒pGEX-5X-1/polFN-α经过EcoR 1和Xho Ⅰ限制性酶切后可见501 bp的目的 片段,提取质粒测序鉴定,结果与GeneBank中的序列一致.转化入E. coli BL21中32℃条件下经IPTG诱导5 h,提取总蛋白,SDS-PAGE检测显示带有GST标记的rpoIFN-α能高效表达,分子量约45 ku,可溶性rpoIFN-α约占菌体蛋白的0.35,Western-blot鉴定显示有特异性条带.效价滴定结果表明该rpoIFN-α具有抗病毒活性,纯化后效价为7.5×106 IU/ml,比活性达到1.1×107IU/mg.结论 成功克隆了polFN-α基因,并可在大肠杆菌中高效表达具有抗病毒活性的rpoIFN-α.