猪瘟病毒荧光定量PCR标准阳性模板的构建

摘要

设计扩增猪瘟病毒(swine fever virus,SFV)核酸5'端非翻译区的引物,采用RT-PCR方法克隆目的片段并插入PMD-18 simple T质粒,重组质粒转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,提取质粒经PCR和序列测定证实为阳性重组质粒,命名为pSF.将构建的pSF作为标准阳性模板进行荧光定量PCR(FQ-PCR)检测表明,此模板在-20℃保存6个月对结果无显著影响;对于1×109,1×107,1×105拷贝/2μl的pSF用FQ-PCR方法测定的Ct值最大变异系数分别为1.55%;使用该模板建立的定量范围为1×102～1×1011拷贝/2μl;构建的阳性重组质粒pSF具有良好的稳定性和特异性.该方法可以用于临床诊断.