非洲猪瘟病毒核酸双重TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的构建

摘要

研究在利用世界动物卫生组织(OIE)推荐的TaqMan荧光定量PCR方法基础上,增加内标物TaqMan荧光,通过优化反应体系及条件,进行Real-time PCR扩增,建立了一种快速、准确、特异性好的非洲猪瘟病毒核酸双重TaqMan探针荧光定量PCR技术,并进行敏感性、稳定性和特异性评价及比较.结果显示:荧光定量PCR标准曲线线性关系良好,R2值可达到1,敏感性最低能检测到28个拷贝数/μL,比常规PCR方法高40～80倍;通过5份标准质粒重复检测3次,每一个样品重复检测Ct值一致,稳定性良好,变异系数范围0.70％～2.51％;同时每一个样品反应体系中内标物(pUC57-actin)Ct值一致,变异系数范围0.25％～3.44％,因此双重验证了该方法的稳定性;特异性试验证明与猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒(PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)基因组无交叉反应.该方法具有提升准确率和判断监测体系内是否存在干扰物的优点,可以防止样品出现假阴性;适合于血清样品、组织样品和疫苗样品的非洲猪瘟病毒核酸检测.