鸭甲型肝炎病毒1型与3型双重TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

摘要

旨在建立一种针对鸭甲肝病毒1型(DHAV-1)和鸭甲肝病毒3型(DHAV-3)的高效快速、高灵敏度和高特异性的双重TaqMan实时荧光定量PCR(q-PCR)检测方法并应用于临床疑似样品检测.根据DHAV-1和DHAV-3的VP1基因保守区域,分别设计合成了2对特异性引物和探针,在此基础上建立并优化了双重TaqMan实时荧光定量PCR方法.结果显示:优化后标准曲线的相关系数(R2)均在0.999以上,扩增效率(E)在105％～110％,其组内变异系数(i-CV)与组间变异系数(c-CV)均在0.77％以下.运用双重q-PCR方法对不同稀释度的混合质粒与病毒核酸进行检测,结果表明,建立的双重TaqMan q-PCR特异性高;同时检测DHAV-1和DHAV-3的灵敏度均可达10个拷贝,分别是常规PCR方法的1 000倍和100倍.对40份来自苏中、苏北地区的疑似鸭肝炎病毒感染的鸭组织病料进行检测,结果表明,q-PCR方法检出36份阳性病料,阳性率为90％;而常规PCR方法未能检出高Ct值的样品,阳性率为72.5％(29份阳性病料).建立的双重TaqManq-PCR检测方法为DHAV-1与DHAV-3的临床样品检测提供了高效、灵敏、特异的工具,推动了临床分子流行病学调查及病毒定量分析等研究.