槟榔隐症病毒1型TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立

摘要

为了建立一种快速、精准且能定量分析槟榔隐症病毒1型(Areca palm velarivirus 1,APV1)的检测方法.本研究参照GenBank中已登录的APV1全基因组序列,在p21蛋白基因保守区域和p60蛋白基因保守区域之间设计1对特异性RT-PCR引物,并构建阳性重组质粒;在p60蛋白基因保守区域部分设计荧光定量PCR特异性引物和TaqMan-MGB探针,利用阳性重组质粒,构建标准曲线,并对该检测方法的敏感性、特异性、稳定性及其应用效果进行验证.结果显示:该方法对阳性质粒标准品检测的敏感性达3.0×101 copies/μL级别,是常规RT-PCR敏感性的100倍;标准曲线显示,Ct值与拷贝数的对数呈线性关系,其标准曲线方程为y=-3.2748x+42.957,扩增效率为102％,相关系数R2为0.9992;该方法对APV1的检测具有较好的特异性,其他槟榔病原物及内生菌不会对本方法产生非特异性干扰;批内与批间重复性试验结果显示,该方法对APV1的检测具有较好的重复性和稳定性;利用该方法对海南万宁、琼海、定安、文昌等4个市(县)采集的181份疑似样品进行检测,阳性率分别为91.95％、86.95％、89.65％、73.68％,其阳性的病毒拷贝数最高达1.59×107 copies/μL,表明海南部分地区APV1病毒载量较高、流行情况比较严重.