牛流行热病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

摘要

为建立一种快速、准确的牛流行热病毒的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法.本研究以NCBI中已公布的牛流行热G蛋白基因保守序列为靶基因设计合成特异性引物和TaqMan探针.利用设计的引物探针扩增检测牛流行热病毒G蛋白基因保守序列,收集到632bp的扩增产物,将扩增产物连接到表达载体pARN上制备重组质粒;将重组质粒穿刺菌划线培养于含Amp的LB培养基,挑选单菌进行扩大培养,提取得到含目的基因的质粒,转入BL21表达菌感受态细胞内,筛选扩增并诱导表达假病毒颗粒;以表达的假病毒作为荧光PCR的阳性标准品,用该标准品进行TaqMan实时荧光定量PCR扩增,通过扩增结果对牛流行热病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的特异性、灵敏度、稳定性进行评价;用该方法对临床样品进行检测,并将检测结果与传统PCR技术进行比较.本研究建立了牛流行热TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,并以检测结果制作标准曲线,得到标准曲线R2=0.9994,说明具有良好的线性关系;特异性实验结果显示,该方法扩增检测标准毒株结果中只有牛流行热病毒有特异的扩增曲线,其他毒株均为阴性,具有较好的特异性;敏感性检测结果表明,该方法的最低检测限度为2.53×10copies/μL;重复性试验结果表明,该方法循环阈值Ct的变异系数(CV)为0.53％～0.91％,具有良好的稳定性;67例临床样品的检测中,所建立的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的检出阳性率较传统PCR方法高10.44％.本研究建立了牛流行热病毒的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,该方法可用于临床上对牛流行热病毒的检测.