鼠痘病毒TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR快速检测方法的建立与应用研究

摘要

目的：建立快速、敏感、特异检测鼠痘病毒的TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR方法. 方法：针对鼠痘病毒血凝素HA基因设计特异性引物和探针,构建含有HA基因的标准质粒进行定量分析,建立TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR检测方法,评价其敏感性、特异性和稳定性.对临床标本中的鼠痘病毒进行检测. 结果：研究结果显示,建立的鼠痘病毒TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR检测方法特异性为100％,与其他正痘病毒属病毒、非正痘病毒属病毒、细菌、真菌、寄生虫和细胞均无交叉反应.该技术灵敏度高,能精确定量检测鼠痘病毒DAN线性范围达10个数量级(100～109拷贝),最低检测限度为4拷贝.该方法重复性非常好,组内变异系数和组间变异系数均小于1％.测试中相关系数、斜率和效率测量线性没有显著变化,表明该方法准确度高、精密度好.将其成功应用于临床标本中鼠痘病毒载量的定量检测,用普通PCR和测序进行确证.整个检测过程可在2h内完成,可以用作快速诊断方法. 结论：本研究新建立的鼠痘病毒TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR方法,具有快速简便、特异性强、灵敏度高的特性,适用于动物源性产品中鼠痘病毒检测、食品和药品安全检查、环境监测、流行病学调查,为临床标本中鼠痘病毒的快速定量检测提供了一种特异有效的评价工具,值得推广应用.