犬瘟热病毒、犬细小病毒二重TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

摘要

为建立一种特异、高通量检测犬瘟热病毒(canine distemper virus,CDV)和犬细小病毒(canine parvovirus,CPV)的二重TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR方法,本研究选取高度保守且具有型特异性的CDV H基因和CPV V P2基因序列,设计CDV和CPV特异性引物对及TaqMan MGB探针;经反应条件优化,建立了检测CDV和CPV的二重TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR方法,并进行了敏感性、特异性和重复性试验.结果显示,该方法检测CDV、CPV的标准曲线线性相关系数(R2)分别为0.997和0.993,最低检出限均为10拷贝/μL,具有较高的灵敏性;对犬副流感病毒等4种病原对照和阴性对照均未出现扩增,特异性良好;CDV、CPV标准品批间试验结果显示,该方法具有很好的重复性;对48份临床疑似CDV或CPV感染样品检测结果显示,14份为CDV阳性,19份为CPV阳性,4份为CDV/CPV双阳性,与CDV H基因、CPV V P2基因测序结果符合率为100％.本研究建立的二重TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR方法具有灵敏、特异、高通量和可准确定量等优点,可用于临床CDV/CPV病毒感染各个时期的快速鉴别检测.