鸭坦布苏病毒、鸭瘟病毒、鸭甲型肝炎病毒1型和3型一步法多重RT-PCR检测方法的建立及其应用

摘要

鸭坦布苏病毒(Duck tembusu virus，DTMUV)、鸭瘟病毒(Duck plague virus，DPV)、鸭甲型肝炎病毒(Duck hepatitis A virus，DHAV)血清1型(DHAV-1)和3型（DHAV-3）均为危害养鸭业发展的重要病毒性病原，为了快速检测这几种病毒。本研究建立了DTMUV、DPV、DHAV-1和DHAV-3的一步法多重RT-PCR检测方法，并对该方法的灵敏度、特异性和重复性等要素进行评估，并将建立的方法应用于病料的鉴别诊断，结果如下:
　　1.DTMUV、DPV、DHAV-1和DHAV-3一步法多重RT-PCR检测方法的建立
　　根据DTMUV、DPV、DHAV-1和DHAV-3在GenBank上全基因组保守序列设计四对引物，以4种病毒的核酸为模板，通过对反应退火温度和引物浓度等条件进行优化，建立了一步法多重RT-PCR方法，分别能扩增出322bp、804bp、648bp和1314bp的目的片段。特异性试验结果显示:以鸭乙肝病毒、禽流感病毒、鸭圆环病毒、鹅细小病毒、鸭疫里默氏杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和健康鸭脾脏组织为模板的扩增结果均为阴性。对同一批次的阳性样本三次重复检测的结果一致。敏感性试验结果显示:DTMUV、DHAV-1和DHAV-3最低检出限均为0.1pg，DPV最低检测限为1pg，而同一体系中同时检测出DTMUV、DPV、DHAV-1和DHAV-3四种病毒的最低检测限为1pg。
　　2.建立的一步法多重RT-PCR样品检测的应用
　　选择上述病毒对无母源抗体7日龄健康雏鸭攻毒模拟混合感染，采集脾脏和法氏囊共108份样品，采用建立的一步法多重RT-PCR方法和经典的其他PCR方法检测结果显示:对于DTMUV、DPV、DHAV-1和DHAV-3的检测结果阳性符合率分别为98.3％、100％、96.7％和97.4％，阴性符合率分别为87.5％、100％、97.4％和95.7％，也表明了建立的方法可信度高。应用该方法对67例广汉、什邡、德阳、邛崃、眉山、绵阳、乐山、简阳及云南等地送检样品进行检测，结果显示:检出DHAV-1和DTMUV阳性病料分别为16份、4份，检出率分别为23.9％、6.0％，均未见混合阳性样品检出，且DPV和DHAV-3检测结果均为阴性。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一部分文献综述

1病原简述

2分子生物学检测技术

2．1核酸探针杂交技术

2．3巢式RT-PCR技术

2．4实时荧光定量PCR

2．5环介导等温扩增技术

3多重PCR技术简介

3．1多重PCR检测方法

3．2多重PCR在诊断病毒学研究中的应用

3．3多重PCR方法在兽医中的应用

4本研究的目的意义

第二部分试验部分

1试验材料

2试验方法

3试验结果

4讨论

第二章鸭坦布苏病毒、鸭瘟病毒和鸭甲型肝炎病毒的一步法多重RT-PCR检测方法的初步应用

1试验材料

2试验方法

3试验结果

4讨论

结论

参考文献

致谢

附录

作者简历