泛素E3连接酶对多发性骨髓瘤细胞增殖、克隆形成能力的影响

摘要

目的 明确泛素E3连接酶(DTL)对多发性骨髓瘤细胞增殖、克隆形成的影响,并探讨其机制.方法 提取34例多发性骨髓瘤患者骨髓中CD138+细胞后,以14例健康志愿者骨髓单个核细胞为对照,实时定量PCR检测DTL在mRNA水平的变化,并选取12例骨髓瘤患者和2例对照,Western blot检测DTL在蛋白水平的变化.同时,入骨髓瘤细胞系RPMI8226分为对照(CON)与DTL敲低(DTL-shRNA)组,感染10感染复数CON与DTL-shRNA病毒48 h,使用流式细胞仪确认慢病毒的感染效率、实时定量基因扩增荧光检测系统和Western blot确认在mRNA和蛋白水平的敲低效率,使用细胞增殖及毒性检测试剂盒检测细胞在随后的0、24、48、72、96h的细胞数量变化,将CON与DTL-shRNA细胞培养于半固体培养基中,10 d后倒置相差显微镜观察大于50个细胞的克隆数量,并使用膜联蛋白Ⅴ/碘化丙啶双染法检测凋亡的变化,碘化丙啶染色检测细胞周期的变化.使用Western blot检测核因子-κB (NF-κB)通路中P65和抑制因子κBα(IκBα)磷酸化水平的改变、凝胶迁移实验检测NF-κB转录活性的变化.结果 健康志愿者骨髓单个核细胞与骨髓瘤患者CD138+细胞中,DTL的表达量分别为1.00±0.12和9.36±3.71(=3.65,P=0.0024),DTL在骨髓瘤CD138+细胞中蛋白水平同样呈现过表达.RPMI8226感染CON与DTL-shRNA病毒48 h后,绿色荧光蛋白阳性细胞的比率为90％,CON组与DTL-shRNA组DTL在mRNA水平相对表达量分别为1.00±0.01和0.21 ±0.04 (t=33.19,P＜0.0001),在蛋白水平DTL的相对表达量分别为0.52±0.13和0.11 ±0.02(t=5.399,P=0.0057).CCK8检测CON组与DTL-shRNA组细胞增殖后显示0、24、48、72、96h的细胞增殖倍数分别为1.00±0.03比1.00±0.02、2.19±0.28比1.47 ±.0.13、3.50±0.14比2.24±0.19、5.43±0.41比3.08±0.14、7.42±0.17比4.29±013 (F =24.58,P=0.001).检测CON组与DTL-shRNA组的克隆形成后显示,DTL-shRNA组大于50个细胞的克隆不可见,CON与DTL-shRNA克隆形成数量分别为76±4比0(P＜0.01),在细胞周期中,CON与DTL-shRNA组G1期细胞比例分别为(28.61±8.64)％比(57.25±10.37)％(t=3.675,P=0.0213),细胞凋亡中,CON与DTL-shRNA组膜联蛋白Ⅴ+细胞比例为(3.21±0.89)％比(34.71±18.68)％(=2.895,P=0.0443).RPMI8226感染CON与DTL-shRNA慢病毒48h后,CON与DTL-shRNA磷酸化P65相对表达量分别为1.52±0.14和0.82±0.11(t=6.81,P=0.0024),而P65的表达分别为0.25±0.04和0.24±0.08(=0.19,P=0.85),差异无统计学意义,CON与DTL-shRNA磷酸化IκBα的相对表达量分别为0.19±0.03和0.13±0.02(t=2.882,P=0.0449),而IκBα相对表达量分别为0.22±0.05和1.01±0.06(=17.52,P＜0.0001).凝胶迁移实验检测DTL-shRNA NF-κB转录活性进一步确定了DTL的下调抑制了NF-κB转录活性.结论 DTL在多发性骨髓瘤细胞中高表达,且DTL的下调抑制了细胞增殖,阻断了克隆形成,促进细胞凋亡和细胞周期阻滞,而DTL对骨髓瘤细胞生物学功能的影响与NF-κB通路的改变相关.